细胞培养

提供营养物质书上就是这么写的

0.09%的生理盐水

楼上说的有理,看情况的.不过一般T25用1ml,T75用2-3ml,T150用5ml,T300用8ml

提供全面的营养。

细胞培养液的储存方法：细胞培养液的储存条件一般为2～8℃、密闭、避光保存，但要注意如下几点：（1）过滤后的完全培养液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培养液要尽快使用，一般在2～3周内使用完。（2）灭菌后的未加L-谷氨酰胺等添加剂的培养基溶液，一般可在4℃保存6～9个月，也可冷冻保存，用时解冻。（3）高压除菌后的培养基应置4℃保存，不能因为其可耐受高温而忽略储存温度。（4）添加了谷氨酰胺的培养液放置2周后，要补加和原来同样量的谷氨酰胺，但这样并不能消除谷氨酰胺降解产生的游离氨，建议配制好的培养液尽快使用。（5）添加某些生长因子、激素等添加物，可能会改变培养液的储存条件，比如温度、时间等方面的要求。

取决于细胞类型或者说生长/新陈代谢的速度，一般哺乳动物细胞在2-4天换液的比较常见

一、细胞培养所需的培养液 在细胞的研究和利用过程中，最主要的是要为细胞提供最适的生长条件，保持细胞培养开始时的群体状态。这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规，而且细胞培养，试剂昂贵，费时、费力，不是随随便便就可以进行的。 细胞只有在最适生长条件下，才会保持正常的核型及功能。如果培养条件上打折扣，就意味着会出现带有染色体重排或突变变异株细胞。某些营养成分或生长因子用量不足或细胞高密度培养时间过长，都不是最适生长条件。 二、平衡盐溶液 平衡盐溶液具有维持渗透压、调节酸碱平衡的作用，同时可以供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。最常用于洗涤组织或细胞、配制培养用液的基础溶液是Hanks 溶液和磷酸缓冲盐溶液（简称PBS) 。 三、血清 血清中含有丰富的营养成分，包括多种生长因子及许多未知成分。动物细胞的生长都依赖血清。血清的种类很多，包括胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等。 选择一批最适于细胞的血清是很重要的，而且如有可能的话，应要求购买来源公司保留足量，以供应实验使用。这样可避免反复试用以选择最适血清所产生的费用。血清的质量可以通过检测细胞的克隆形成率来衡量。取对数生长期的细胞彻底消化后，以低密度（直径6mm 的平皿中加入约103个细胞）接种5~6 个平皿， 其中一个平皿中加入含30％血清的培养液，以测定高浓度血清的细胞毒作用。7~ 10d 后，出现肉眼可见的克隆时，倒掉培养液， 2％亚甲蓝染色2~5min,观察克隆形态、计算克隆形成率。克隆形成率一般为5%~ 10%。 四、抗生素 一般细胞培养时，抗生素不是必需添加成分。但一些特殊情况下培养液内需加入适量的抗生素，如怀疑有污染、原代培养时、新手操作不够熟练。常用的抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素。青霉素常用剂量为100U/ml ,链霉素常用剂量为100μg/ml。常配制成100 倍或200 倍， 分装为小包装， 于－20℃条件下保存。一次用一个小包装， 避免反复冻融 。 五、特殊的添加因子 特殊的添加因子可以使细胞培养的条件得到优化。原代培养细胞接种密度需适当提高，应尽可能用营养丰富的培养液，如使用胎牛血清。这些都属于一般优化条件。细胞培养条件优化的原则是：根据细胞类型， 模拟体内环境， 添加不同的细胞生长因子及有利于细胞生存、增殖的添加剂。表1 是常用的细胞培养添加成分。 表 1 常用的细胞培养添加成分 一种细胞生长因子常常是多种细胞的丝裂原，如碱性FGF, 不仅是成纤维细胞的丝裂原，还是内皮细胞、角质细胞、黑素瘤细胞的丝裂原。EGF 可促进上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞及平滑肌细胞等多种细胞的增殖。 培养干细胞时，常添加白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF ) ，又称分化抑制因子( DIA )， 是一种分泌型多肽，可抑制小鼠干细胞的自然分化。一般，可用纯化的LIF 直接加到培养液中，或使用用LIF表达载体转染过的饲养层细胞。正常的STO 细胞也可分泌。STO 细胞还分泌其他一些促干细胞生长的因子。目前，多数实验室仍使用饲养层细胞。重组的LIF 来源方便，与STO 细胞一起使用时，常用浓度为1000U/ml 。与小鼠胚胎成纤维细胞一起使用时，常用浓度为500U/ml 。 体外培养正常细胞需要使用不同生长因子的选择性组合。通常在已有的经典培养液配方基础上，添加不同因子而成。现在已有多种特定细胞培养液，且有商品供应，如血管内皮细胞培养液、神经干细胞培养液、骨髓干细胞培养液、间充质干细胞培养液、小鼠心肌细胞培养液(Claycomo Medium) 等。 六、消化液 细胞生长至一定密度时，需进行传代。消化液可使细胞脱离生长表面，离散成单个细胞。常用的消化液是0.25%、0.125％的胰蛋白酶和0.02％的二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 溶液，以无钙镁的PBS 或Hanks溶液配制。它们可单独使用，也可按一定比例混合后使用。大部分细胞的消化可使用终浓度为0.05%胰蛋白／0.02%EDTA混合液。有些上皮细胞贴壁力强，需较高浓度的胰蛋白酶(0.25%）或延长消化时间，甚至需要37°C温育。如果温育较长时间（超过20min)细胞仍不能脱壁，则应采取分步消化的措施，即将已脱壁细胞移出至离心管，加完全培养液中和胰蛋白酶的作用，对未脱壁的细胞再添加新胰蛋白酶再次消化。 七、细胞培养用的其他液体 细胞培养时，还会用到其他一些液体，如谷氨酰胺、HEPES 、丙酮酸钠、各种细胞生长因子、各种组织或细胞条件培养液，以及调整pH 使用的5.6%NaHCO3等。 谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，会导致细胞因生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故要适时添加。可配制200倍液体－20℃ 冰箱中保存，在使用前加入培养液内，终浓度为2mmoVL 。 HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2~7.4 范围内具有较好的缓冲能力，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠( 0.34g/L)共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。安全浓度范围10~25mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。一些生长缓慢的细胞加入，可明显改善细胞状态。通常配制200倍液，-20℃ 冰箱保存，在使用前加入培养液内终浓度为1mmol/L。 另外， 2－巯基乙醇(2-Mercaptoethanol, 2-Me) 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清， 有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA) 对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术。也开始用于一些难以培养的细胞。常用终浓度为5×10-5mol/L。常配制成0.1mol/L 的储存液，用时每升培养液加0.5ml 。

面稳定性好,细胞贴附力强等特点,缺点培养的细胞未涂有抗体。

植物细胞培养的原理：在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于，液体培养基中进行震荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 植物细胞是植物生命活动的结构与功能的基本单位，由原生质体和细胞壁两部分组成。原生质体是细胞壁内一切物质的总称，主要由细胞质和细胞核组成，在细胞质或细胞核中还有若干不同的细胞器，此外还有细胞液和后含物等。

细胞培养是指从开始传代到收获细胞，这整个过程。细胞接种是指细胞培养一开始加细胞，这个初始阶段就是细胞接种。

一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。 三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。 正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。 原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。 四、冻存及复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 五、常用仪器设备 无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。

植物细胞由琼指块加以营养液

设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。器材：一、玻璃器材 无菌室培养皿、滴流瓶、刻读吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶二、塑料器材多孔培养板、培养皿、培养瓶三、橡皮器材橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。四、金属器材剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头五、其他物品纱布、注射器和针头来自百度百科

原代细胞：处理组织，分离细胞，原代细胞培养，传代细胞系：细胞培养，传代可以体外培养增殖细胞，用于研究细胞功能、基因功能、疾病研究等科学研究，也可用于临床治疗

几种常用细胞培养基产品⒈ BME（basal medium eagle）基础伊格培养基⒉ MEM⒊ DMEM⒋ IMDM⒌ RPMI-1640⒍ M199⒎ Mccoy"s 5A⒏ F10 F12 DMEM混合F12（三）几种常用细胞培养配套试剂的配置（缓冲液、平衡盐溶液等）1、无钙、镁、离子溶液（1000ml)氯化钠（NaCl)8g磷酸二氢钠、（NaH2PO4H20）0.05g、氯化钾（KCl)0.2g、碳酸氢钠（NaHCO3）1g、柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20）1g、葡萄糖1g、加去离子水或双蒸水至1000mL2、PBS（Phosphate-Buffered saline）磷酸盐缓冲液甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钠（无水）28.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL乙液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钠（无水）2.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL甲、乙液于4℃保存，使用时按表3-2所示比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。3、Hanks液（HBSSHank‘s Balanced salt solution)⑴母液甲（20x）配法①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O（A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌（此液应单配，单溶）。待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。⑵母液乙（20×）配法①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖（A.R)20.0g溶于800ml双蒸水中。②0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4℃保存。待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存。3）使用液（1×）配法取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115℃高压灭菌25分钟（以免葡萄糖破坏），置室温后4℃保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。4、Eagle"s液（EBSSEagle"s Balanced salt solution)是一种在二氧化碳（CO2）环境中短期维持细胞活性的平衡盐溶液，可用于细胞解离前的清洗、细胞或组织的运输、细胞计数时稀释、溶液的配置等。5、HEPES液生物缓冲液，化学性质稳定，在PH7.2~7.6范围内，比NaHCO3缓冲液的缓冲能力更强。6、NaHCO3缓冲液常规缓冲体系的一部分，但是不稳定，易受空气中CO2的含量而改变PH值，影响缓冲效果。

⒈可以进行植物体外受精及 植物胚胎发育过程研究。⒉可以进行植物生长发育有关的重要基因或影响因素的研究。⒊可以方便地通过实验手段培育植物新品种。

动物细胞培养与植物组织培养的区别培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要。产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。

有,贴壁传代 说明培养的是动物细胞.动物细胞在培养瓶中贴壁传代到一定时候,细胞越来越多,会将瓶壁贴满,这时细胞应该就不会分裂啦.老师好象是这样说的...如果你想将它们分装,可以定期地用胰蛋白酶使它们从瓶壁上脱落下来,制成细胞悬浮液,然后分到几个培养瓶中培养

培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。 1水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。 2无机元素(inorganic element)大量元素指浓度大于0.5mmol／L的元素等。其作用是： (1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3—N和NH4—N两种形式供应。大多数培养基既含有N03—N又含NH4—N。NH4—N对植物生长较为有利。供应的物质有KNO3、NH4NO3等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。 (2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植 物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。 (3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1—3mg／L为好。制备培养基时，常以KCI、KN03等盐类提供。 (4)Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO4u20227H20提供。用量为1—3mg／l较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl2u20222H2O提供。 微量元素 指小于0.5mmol／L的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值5．2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO4u20227H20和Na2—EDTA结合成合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。3.有机化合物(organic compound)培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。4.天然复合物其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。 1)椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%—20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1nun时，椰乳就不发生作用。 2)香蕉 用量为150-200ml／L。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。 3)马铃薯(potato) 去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150—200g／L。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。 4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100—200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%～0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。

动物细胞培养的原理是细胞增殖，动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。一、细胞增殖的意义：1、细胞增殖是生物繁殖的基础：单细胞生物以细胞分裂的方式产生后代；多细胞生物的繁殖和发育的基础、2、细胞增殖是高等生物完成正常生命活动的基础：细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。二、细胞通过分裂进行增殖：细胞增殖是细胞重要的生命活动，是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础。1、单细胞生物：细胞增殖而繁衍。2、多细胞生物：从受精卵开始，要进行细胞的增殖和分化逐渐发育成个体。3、真核细胞的分裂方式：有丝分裂、无丝分裂、减数分裂。

分别是细胞增殖（细胞分裂），动物细胞核的全能性。后面两个是一样的核移植就可以克隆动物。。没问题，这个我很熟

组织培养 tissue culture从体内取出组织模拟体内生理环境,在无菌、适当温度和一定营养条件下生存和生长并维持其结构和功能的方法.常用上皮组织:胚胎发育的内、中、外三个胚层均可分化成上皮组织.细胞形态较为规则,细胞间常以黏着物和特殊连接牢固相连.身体不同部位的上皮组织,所处的位置有着不同的功能,主要表现为保护、吸收、排泄和分泌等功能.分为被覆上皮、腺上皮、感觉上皮、生殖上皮和肌上皮等.上皮细胞浓度：（1～3）x105/ml成纤维细胞浓度：（2～6）x105/ml细胞培养 cell culture培养物是单个细胞或细胞群.细胞在培养时都要生活在人工环境中,由于环境的改变,细胞的移动或受一些其他因素的影响,培养时间加长,传代导致细胞出 现单一化型.器官培养 organ culture器官培养：与组织培养条件相似,培养的是器官的原基,器官的一部分或整个器官,以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法.

一、细胞培养的条件和要求 1.所有与细胞接触的设备、器材和溶液等，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。 目前最可靠和最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。 如：玻璃制品、布类、金属制品：6.8kg20min。 橡胶制品：3.6～4.5kg10min。 培养用液，如Hanks液，水解乳蛋白：3.6～ 4.5kg10min。 实验中染菌物品和动物尸体等：6.8 kg20min。 试管、吸管等，则可采用干热灭菌； 一切不适于加热灭菌的液体，如人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶等溶液，可采用过滤法除菌。 细胞培养中常用的消毒剂浓度及其使用场合 2.必须有足够的营养供应，而绝对不可有有害的物质，包括极微量的有害离子的掺入，为此必须注意器材的清洗和配液用水的质量。 细胞培养中对水的质量要求很高（见水处理）。 3.保证有适量的氧气供应。 细胞代谢需要有空气，否则细胞死亡。在用培养瓶进行静止培养，或用转瓶进行旋转培养时，只要培养的液体量不超过总容量的30％，通过与液面的空气交换，可以保证细胞有足够的氧气。当用罐子深层培养时，则必须通气，一般采用含5％CO2的空气，或根据需要将CO2、N2、O2和空气以不同比例混合，过量氧对细胞的生长也不利。 4.需随时清除细胞代谢中产生的有害产物。 细胞在代谢过程中会产生大量代谢废物，如CO2、乳酸、氨、尿素、吲哚等，这些产物对细胞的生存有害，必须及时清除。在小量培养时，当培养基中酚红指示剂显示黄色，表示已有相当量乳酸产生，要及时更换新鲜的培养基。在大量培养时，则需随时测定葡萄糖和乳酸等含量，并调节灌流速度，使代谢产物保持在无害水平下。 5.有良好的适于其生存的外界环境，包括温度、pH、渗透压和离子浓度等。 不同的细胞对pH的要求不同，一般来说适于细胞生长的pH在6.8～7.4，过高或过低均不利于细胞生长。如上所述，细胞在代谢过程中会产生大量乳酸，使培养的pH下降。为了保持培养液的pH，常在培养液内加入各种缓冲系统，如Na2HPO4/Na2HPO4、NaHCO3/H2CO3（CO2）、Tricineglycine，以及加缓冲剂Hepes液（常用浓度为10～50mol/L）. 6.及时分种，保持合适的细胞密度（见细胞传代） 二、细胞分离 1.人白细胞的分离。 常用于IFN－α和γ的制备。 它主要来源于献血者的静脉血，也可来自手术时体外循环剩余血，分娩时脐带血，以及脾脏和扁桃体等组织。 2.人胚肌皮细胞的分离 。用于IFN-β的制备 。 三.体外培养细胞龄的计算 二倍体细胞龄以细胞群体倍增计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即1瓶细胞传2瓶（1：2分种率）再长满瓶为一世代；1瓶传4瓶（1：4）为二世代；1瓶传8瓶（1：8）则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。 传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。依据每个细胞系的实践经验数据，确保细胞质量及安全，确定生产使用细胞最后限制代次。 四.细胞鉴别试验 新建细胞系或株、细胞库和生产结束时的细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞。可采用遗传特征、DNA指纹图谱、染色体标记、免疫学、HLA和生化法（如同功酶）测定，任选其中一种方法。有简便而能鉴别的方法亦可采用，但需经国家药品检定机构认可。 人二倍细胞株来源于正常人胎肺或其他组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。 1.细胞株的要求 人二倍体细胞株须按下列要求进行全面检定。 （1）建立细胞株必须具备下列资料 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，终止妊娠原因。 建立细胞株所用的胎儿父母的年龄、职业及健康状况（经医生出具证明），胎儿父及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史。在取胎儿组织前，应做出详细调查。 原始组织种类，原始细胞培养的细胞数量与生长的状况。 细胞培养方法、历史、生长特征和寿命的世代数。 细胞生长液的成分。

1、实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%乙醇擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株的操作。2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4、工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassⅡ）。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5、定期检测下列项目：5.1CO2钢瓶之CO2压力5.2CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750），定期更换水槽的水6、粉末培养基配制好后（加了血清），一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，细胞娇弱，放置时间不宜过长。7、开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将其放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用时也一定要勤换水。从水浴锅拿出后，最好找个毛巾擦干上面的水。

细胞培养技术是细胞工程的基础技术。所谓细胞培养，就是将生物有机体的某一部分组织取出一小块进行培养，使之生长、分裂的技术。在体外细胞培养中，供给离开整体的动植物细胞所需营养的是培养基，培养基中除了含有丰富的营养物质外，一般还含有刺激细胞生长和发育的一些微量物质。培养基一般有固态和液态两种，它必须经灭菌处理后才可以使用。此外，温度、光照、振荡频率等也都是影响培养的重要条件。

1、能长期传代，保持活性，便于监控检测结构功能和生命活动。2、培养条件可以人为的控制便于研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响3、可用于各种观察和检测手段研究活细胞的变化（变异、分化）。可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达。4、研究范围和细胞来源广泛，选择性广。5、不同代次细胞可长期保存，既可开展同代次不同条件和方法研究，又可观察不同代次的动态变化。6、耗资少、经济、成本低、可大量培养，利于生物制品的生产。

1、实验材料要新鲜，从活体分离材料后要低温保存，并尽快进行细胞分离实验。2、无菌操作。操作时用的培养液，可加平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。3、用酶法分离细胞时，注意酶液的浓度和控制消化时间。贴块法分离细胞时，注意动作要轻柔，不要伤到细胞组织，组织块边缘尽量平整有利于细胞游离。4、培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同，根据所分离细胞的特性选择。传代细胞培养还要注意：1、无菌操作；2、控制消化时间；3、及时关注细胞生长状态

温度高或者温度低都利于细胞且温度高让细胞死亡温度低

原代动物细胞培养：1、实验材料要新鲜，从活体分离材料后要低温保存，并尽快进行细胞分离实验。2、无菌操作。操作时用的培养液，可加平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。3、用酶法分离细胞时，注意酶液的浓度和控制消化时间。贴块法分离细胞时，注意动作要轻柔，不要伤到细胞组织，组织块边缘尽量平整有利于细胞游离。4、培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同，根据所分离细胞的特性选择。传代细胞培养：1、无菌操作2、控制消化时间3、及时关注细胞生长状态

动物细胞培养的过程一般分为（分离）和（培养）两个阶段，细胞培养需要理想的气体环境，多数细胞需要氧张力才能生长。氧含量应略低于大气状态，二氧化碳为细胞生长所需也是细胞代谢产物，与维持培养基PH值相关。 幼龄动物--->剪碎组织--->胰蛋白酶处理--->细胞培养其中细胞培养又包括原代培养和传代培养

1、要保证实验材料新鲜，从活体分离材料后要注意低温保存。2、要保证无菌操作。可以在操作时用的培养液中加入平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。3、要注意酶液的浓度和控制消化时间。4、要注意培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同，根据所分离细胞的特性选择。

不要远离酒精灯，不要靠近废液缸。东西不要用太久，经常高压。不要对朝着培养箱说话。操作中别说话，尽量少走动。瓶口不要打开太久。实验室条件和个人操作习惯都会导致污染，一般个人因素大一些

动物细胞培养（animal cell culture）:从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。基本过程:取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。此时的细胞被称为细胞系。

1、无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。为保证细胞能在体外环境中生长繁殖，必须要确保无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。 2、常见的微生物污染有支原体、细菌、真菌。支原体无致死毒性，可与细胞长期共存，对细胞有潜在影响，但体积小，不易鉴别，可借助于地衣红或Hoechst33342染色来进行检测。细菌增殖快，在短时间内即可大量扩增，并产生毒素杀死细胞。真菌的种类繁多，肉眼可见，漂浮于培养液面上，可呈丝状、管状或树枝状等。 3、一般哺乳类与禽类细胞在体外培养的适宜温度是37～38℃，不适宜的环境温度会影响细胞的生长。细胞对低温的耐受能力要强于对高温的耐受能力，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂能力降低。若温度不低于0℃，虽然细胞代谢受到影响，但无损伤作用；25～35℃时，细胞以缓慢的速度生长；但若被置于40℃数小时，则不仅不利于细胞生存、生长，甚至可导致其死亡。 4、高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。 5、细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。在开放式培养中，以5%的二氧化碳气体比例为宜。

1、能长期传代，保持活性，便于监控检测结构功能和生命活动。2、培养条件可以人为的控制便于研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响3、可用于各种观察和检测手段研究活细胞的变化（变异、分化）。可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达。4、研究范围和细胞来源广泛，选择性广。5、不同代次细胞可长期保存，既可开展同代次不同条件和方法研究，又可观察不同代次的动态变化。6、耗资少、经济、成本低、可大量培养，利于生物制品的生产。

1、无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。为保证细胞能在体外环境中生长繁殖，必须要确保无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。2、常见的微生物污染有支原体、细菌、真菌。支原体无致死毒性，可与细胞长期共存，对细胞有潜在影响，但体积小，不易鉴别，可借助于地衣红或Hoechst33342染色来进行检测。细菌增殖快，在短时间内即可大量扩增，并产生毒素杀死细胞。真菌的种类繁多，肉眼可见，漂浮于培养液面上，可呈丝状、管状或树枝状等。3、一般哺乳类与禽类细胞在体外培养的适宜温度是37～38℃，不适宜的环境温度会影响细胞的生长。细胞对低温的耐受能力要强于对高温的耐受能力，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂能力降低。若温度不低于0℃，虽然细胞代谢受到影响，但无损伤作用；25～35℃时，细胞以缓慢的速度生长；但若被置于40℃数小时，则不仅不利于细胞生存、生长，甚至可导致其死亡。4、高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。5、细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。在开放式培养中，以5%的二氧化碳气体比例为宜。

细胞培养的概念：细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。细胞培养成功的关键因素：1.要保证无菌,包括无菌操作,无菌环境.枪头等要及时灭菌,培养瓶,移液管最好使用一次性的,如果你的细胞比较不好养,最好使用一次性的.2.要传代的时候细胞传代的数量不能太少,否则细胞不容易养活.另外,传代不要过度频繁,即使是肿瘤细胞.3.不要经常用胰酶消化细胞,且消化时间不要过长.4.根据细胞生长情况,即使更换新鲜培养基.5.血清一般要冻存在-20摄氏度,用的时候在4摄氏度融化,不要反复冻存,最好用10ml的离心管分装使用.

细胞培养细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。 细胞培养技术的研究应用 1. 直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2. 直接观察细胞的变化可便于摄影。 3. 研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4. 便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5. 是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6. 易于施用物理、化学生物的实验研究。 7. 易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8. 成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。

有专门的检测细胞培养过程中氧气和二氧化碳的精确检测设备，参考网站 ——上海永州实验设备有限公司

一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

细胞复苏可以推荐美国BioLife百奥莱的ThawSTAR系列细胞程序复苏仪Biolife百奥莱ThawSTAR细胞程序复苏仪细胞的存储与转运要在低温冻存条件下实现，细胞的提取与应用通常采用水浴的解冻复苏方式，而传统的水浴解冻复苏又面临着无法程序控制管理，人为的主观错误判断及水浴污染带来了一定的风险。2019年4月美国BioLife Solutions公司全资收购美国Astero公司及其细胞程序复苏知识产权，ThawSTAR 细胞程序复苏技术的高端机型开发得到了注资，其中CFT系列机型已经在各地生物药企、研发公司，高校科研单位，甚至医院实验室内均有使用，复苏效果得到了业内认可。上海朗喜工业科技有限公司作为Astero中国区合作伙伴，在中国大陆、香港及台湾销售Astero全系列产品。ThawSTARu2122 细胞程序复苏仪是一款细胞程序复苏的仪器。与传统的水浴操作相比，该仪器操作简单、重复性好，可有效避免操作过程中污染风险。由于仪器自动执行一系列程序复苏操作，因此排除了基于操作者主观推测因素造成的错误操作和污染的风险，再现性高！ThawSTARu2122 系统适用于干冰、-80℃冰箱、液氮等保存的冷冻细胞。操作简单，如，ThawSTAR CFT2 仅需要插入冻存管等待结束即可，处理完成时，冻存管会自动弹出。ThawSTARu2122 CFT 细胞程序复苏仪可以直接在生物安全柜BSC内进行工艺操作！

细胞培养首先分为原代培养和传代培养. 原代培养需要从组织中消化、分离、纯化出单细胞,然后继续进行传代、冻存； 传代培养首先： 细胞复苏: 1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-38度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化. 2.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养瓶内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养,24h后换液；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后,完全培养基重悬培养,适时换液. 细胞传代: 1.贴壁细胞: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死细胞,50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后收集离心（1000rpm 5min左右）,新鲜培养基重悬沉淀,加入完全培养基后继续培养或实验. 2.悬浮细胞: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度或需更换新培养基,可先离心（1000rpm,5min左右）后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养. 具体更详细的你还是看看细胞培养的专业书吧!

轻轻吹打,可先离心（1000rpm. 2,如要高浓度或需更换新培养基,新鲜培养基重悬沉淀,置培养瓶内轻轻摇晃: 1,吸的越干净越好,(根据配制强度经验),镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后. 一,然后收集离心（1000rpm 5min左右）,50ml培养瓶加入消化液约0；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后,以免中和后加入的消化液,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后继续进行传代、传代培养首先进行细胞复苏,使细胞基本成单个悬浮,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞细胞培养首先分为原代培养和传代培养、冻存,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化,晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,24h后换液.贴壁细胞.6ml,加入完全培养基继续培养、原代培养需要从组织中消化,去除血清和死细胞,轻轻吹匀后.悬浮细胞,加入完全培养基后继续培养或实验: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,加入2-3ml完全培养基后,适时换液,按此比例进行消化.PBS清洗2-3次,使强度减弱,使细胞均匀后置培养箱内培养: 1,5min左右）后加入完全培养基,完全培养基重悬培养. 2.先将水温锅调至37-38度.应遵守慢冻快融的原则；二、纯化出单细胞、分离. 细胞传代: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养

细胞培养目的与用途有哪些，细胞培养，什么是细胞培能了解微生物的习性,细菌与某些疾病的关系.作用有:有些细菌可以制作药物,食品与生物塑料

细胞培养是指用体外培养的正常细胞，或者是导入外源基因的细胞，或者是利用由干细胞诱导分化而来的特定细胞，植入患者病变部位以代偿病变细胞丧失的功能。例如血液系统恶性肿瘤治疗时，通过放疗彻底杀灭肿瘤细胞，同时摧毁患者的造血系统，然后移植健康供者的骨髓，即人们常说的骨髓移植，就是最常见的细胞治疗。 　　人胚胎干细胞的建系为细胞治疗提供了更大的可能性。在利用胚胎干细胞作细胞治疗时，首先要考虑克服异体移植中的免疫排斥反应，其方法是将人胚胎干细胞进行MHC基因操作，建立可供移植对象配对选择的各种MHC组合的胚胎干细胞库。在这基础上，根据不同的移植对象和要求，或直接定向诱导分化为功能性细胞（如神经细胞、神经胶质细胞、软骨细胞等）；或定向诱导分化为组织干细胞（如造血干细胞、神经干细胞等），这类组织干细胞也可直接取材于成体组织或器官，最终植入患者病变部位。另一种途径是将患者的体细胞核导入去核卵细胞或去核胚胎干细胞，体外发育至一定阶段后，从中分离培养出供核患者专用的胚胎干细胞，再经诱导产生所需的分化类型的细胞，回输至供核患者，同样也避免了免疫排斥问题。

由于植物细胞具有全能性，即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并发育成为完整个体的潜力，因而每一个植物细胞可以象胚胎细胞那样，经离体培养再生成植株。植物细胞的“全能性”学说是由1902年德国植物学家哈贝尔兰德提出的。他预言，人有朝一日可以切取植物的一小部分的叶、茎、根，使它们在试管中长成一株完整的植株。经过了长达35年之后，即1937年，美国科学家怀特等人第一次把胡萝卜和烟草植物体上的组织取下一块，放在试管里培育，终于长出新的细胞和组织。1958年，美国一位植物学家斯蒂伍德成功地从一个胡萝卜细胞，培养出了一株具有根、茎、叶的完整植物，并能开花结果。这样，哈贝尔兰德的科学预见终于变成了现实。美国宾夕法尼亚州立大学园艺学家认为，利用植物细胞和组织培养技术培养植物不但可行而且有利。它的好处是：可以避免用种子繁殖时发生的后代变异；可以得到无病害的植物，并且繁殖迅速，一年之内能生产数十万株植物；植物细胞可以放在塑料袋里邮寄，收到后把它放在温室瓶里培养，几天之后就能长成新的植物。特别是木本植物繁育周期长，从种子到下一代，往往需要几年，甚至几十年，如果用试管育苗的办法，对于缩短育种时间和保持植物优质将起到明显的作用。

博凌科为生物科技-为你解答：1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一。培 养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。2、优质血清目前大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最 重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生 物或有毒物质污染或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时必须保持细胞生存环境无菌无毒及时清除细胞代谢产物。4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长必须有恒定适宜的温度。5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一。所需气体主要有氧 气和二氧化碳。

细胞生长要求更高，要求培养基包括生长因子，氨基酸，葡萄糖等营养成分，而细菌的主要营养成分就是蛋白胨，通过自身分解蛋白供能，而且细胞的生长培养基对pH要求更高。

不吃的剩菜剩饭，放着别动，几天就出来了

博凌科为生物科技-为你解答：组织培养 tissue culture从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下生存和生长并维持其结构和功能的方法。常用上皮组织:胚胎发育的内、中、外三个胚层均可分化成上皮组织。细胞形态较为规则，细胞间常以黏着物和特殊连接牢固相连。身体不同部位的上皮组织，所处的位置有着不同的功能，主要表现为保护、吸收、排泄和分泌等功能。分为被覆上皮、腺上皮、感觉上皮、生殖上皮和肌上皮等。上皮细胞浓度：（1～3）x105/ml成纤维细胞浓度：（2～6）x105/ml细胞培养 cell culture培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出 现单一化型。器官培养 organ culture器官培养：与组织培养条件相似，培养的是器官的原基，器官的一部分或整个器官，以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法。

原代细胞：处理组织，分离细胞，原代细胞培养，传代细胞系：细胞培养，传代可以体外培养增殖细胞，用于研究细胞功能、基因功能、疾病研究等科学研究，也可用于临床治疗

动物细胞培养原理是细胞增殖

1、能长期传代，保持活性，便于监控检测结构功能和生命活动。2、培养条件可以人为的控制便于研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响3、可用于各种观察和检测手段研究活细胞的变化（变异、分化）。可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达。4、研究范围和细胞来源广泛，选择性广。5、不同代次细胞可长期保存，既可开展同代次不同条件和方法研究，又可观察不同代次的动态变化。6、耗资少、经济、成本低、可大量培养，利于生物制品的生产。

最基本的条件是无菌培养其次要有四个基本要素：水，碳源，氮源，无机盐根据不同的细胞种类，所需要的温度，pH，光照也不一样而不同的细胞还需要不同的激素，维生素（例如培养乳酸菌要加维生素C），不同的特定无机盐离子（例如水稻需要硅离子）空气：培养动物细胞要用95%空气加上5%二氧化碳（促进呼吸） 培养植物细胞只需通空气

1、要保证实验材料新鲜，从活体分离材料后要注意低温保存。2、要保证无菌操作。可以在操作时用的培养液中加入平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。3、要注意酶液的浓度和控制消化时间。4、要注意培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同，根据所分离细胞的特性选择。无菌操作、控制消化时间、及时关注细胞生长状态。

1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养工作包括：工作液配制、无菌操作(采样)、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。2、常用设施及设备(1)超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。(2)无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。(3)操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。(4)洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。(5)分析间：显微镜、计算机及打印机等。3、培养器皿细胞培养以玻璃器皿为主，常准备最需使用量的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面几种。(1)液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替。(2)培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种。用于外周血培养的常用10ml普通圆瓶。两种培养瓶均要求选用优质玻璃制成。(3)培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm等几种。(4)吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml 两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。(5)离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml;后者则多为10ml和5ml。(6)其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。

细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂（如琼脂）或固体培养物（如麸皮、大米等）便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。细胞培养泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一。

细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织。培养物是单个细胞或细胞群。培养时细胞在都必须生活在人工环境中，因为环境的改变，一些其他的因素可能会影响细胞的移动，使得细胞培养时间变长，传代细胞可能导致出现单一化。下面小编带你了解一下细胞培养技术的优缺点。细胞培养技术的优点1.细胞培养技术能够直接观察活细胞的生命活动与形态结构。在遗传学、细胞学、实验医学、肿瘤学和免疫学等多种学科被应用研究.2.细胞培养技术可以直接观察细胞的变化，方便得到影像。3.细胞培养技术可以研究细胞的类别很丰富。从低等到高等到人类，从胚胎到成年、从正常组织到肿瘤细胞。4.细胞培养技术在观察和研究细胞状况时能够很方便的运用相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等各种技术方法。5.细胞培养技术既是分子生物学和基因工程学的组成部分，也是其主要的研究对象。6.细胞培养技术能够很方便的使用物理、化学生物的实验研究。7.细胞培养可以很方便提供大量生物性状相似的实验对象,而且花费很少，非常实惠。8.细胞培养是生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源之一。细胞培养技术的缺点组织和细胞离体后必须独立生存在人工的培养环境中，虽然是模拟体内环境，但是和体内环境还是有很大的不同。 所以当利用培养细胞做实验时，不应该认为人工的培养环境等同于体内体内环境，轻易得出与体内相同的结果。

细胞培养的基本方法有贴壁培养、悬浮培养和固定化培养。贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞。此类需要相互依赖，需贴附于不起化学作用的物质（玻璃或塑料等无活性物质）的表面生长、生存和维持，并最终在附着面生长至单层，铺满平面时便会发生接触抑制。来源于血液、淋巴组织的细胞，及许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞等属于悬浮培养型细胞，细胞为非贴壁依赖性细胞，无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式，可采用类似于微生物的方法进行悬浮培养。动物细胞较微生物脆弱，易受剪切力等的影响，而细胞固定化技术可较好的保护细胞免受机械力及环境变化的影响，提高细胞的耐受力，促使细胞高密度培养，提高目的产物的产率。

把一个细胞培养成多个细胞。

⒈可以进行植物体外受精及 植物胚胎发育过程研究。⒉可以进行植物生长发育有关的重要基因或影响因素的研究。⒊可以方便地通过实验手段培育植物新品种

细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术.细胞培养的培养物可以是单个细胞,也可以是细胞群. 1.药物研究与开发 　　(1) 新药筛选:如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等.　　(2) 疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.　　(3) 基因工程药物研究与开发:如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等.　　(4) 细胞工程药物研究与开发:生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发.　　(5) 单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体.2,生物制药 　　(1) 疫苗生产:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.　　(2) 基因工程药物生产:如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 　　(4) 细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等

细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。细胞培养成功需注意三个方面：1）物质营养，体外培养细胞所需的营养是由培养基提供的。培养基中通常需要含有细胞生长所需的氨基酸、维生素和微量元素。其中最重要的是血清，含有促进细胞生长的生长因子。2）生存条件，体外细胞培养必须模拟体内生长环境，包括无菌环境、适宜的温度、一定的渗透压和气体环境（CO2和O2）3）废物代谢，培养基上细胞代谢产生的代谢物和废物累积在培养基中阻碍细胞的生长，所有应定期更换培养基。

cell culture,细胞培养，既包括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。

细胞培养是一种常见的生物技术，其步骤主要包括以下几个方面：常规准备：细胞培养基，胎牛血清，无菌操作器具等；细胞分离：将细胞悬浮液通过培养基离心分离并为单一细胞状态；细胞计数：使用细胞计数板，显微镜等设备检测细胞浓度；接种细胞：将细胞悬浮液加入预处理好的培养器皿中；细胞培养及维护：放到合适的培养环境中，进行有利的生长处理（悬浮细胞与贴壁细胞的处理方式各有区别）细胞检测及分裂：在一定时间内，对细胞进行检测，记录细胞数及细胞器发育情况；细胞使用或保存：细胞可以在需要时被收获，进行进一步的科研工作，或保存在液氮罐中，以备后续使用。进行细胞培养时，需要注意以下几点：确保无菌操作：细胞培养应在无菌环境下进行，必要时可使用生物安全柜进行操作；控制细胞温度：在适宜的器皿中提供恰当的温度，对于不同类型的细胞，温度和环境要求是不同的；细胞培养基成分：细胞培养基中有多种成分，一些有组分具有强烈的耗竭作用，应及时更换培养基以供养细胞；细胞处理方法：细胞处理时使用具有其细胞类型特异性的方法；合适的接种密度：不同类型的细胞要求不同密度的接种，过高或过低的细胞密度均会对细胞的生长和分裂产生不良影响；手套和口罩等保护操作：需要保护自己以及细胞免于污染和交叉感染。因此，在进行细胞培养时，需要细心、耐心和科学地操作，这样才能够顺利地进行和成功地完成细胞培养工作。

细胞培养技术是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中，培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。一、动物细胞培养在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。二、植物细胞培养⑴光照：离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质，如药物的过程，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。⑵激素：植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物细胞的分裂，生长，分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套能使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。三、微生物细胞培养微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。所以微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多。其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而好氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然培养基的基础上额外添加。

细胞培养首先分为原代培养和传代培养.一、原代培养需要从组织中消化、分离、纯化出单细胞,然后继续进行传代、冻存；二、传代培养首先进行细胞复苏:1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-38度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.2.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养瓶内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养,24h后换液；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后,完全培养基重悬培养,适时换液.细胞传代:1.贴壁细胞:对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死细胞,50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后收集离心（1000rpm 5min左右）,新鲜培养基重悬沉淀,加入完全培养基后继续培养或实验.2.悬浮细胞:一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度或需更换新培养基,可先离心（1000rpm,5min左右）后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.