现代分子生物学实验技术的内容介绍

PCR单链构象多态性分析变性梯度凝胶电泳双链构象多态分析法变性- 高压液相色谱分析特异性等位基因扩增化学裂解错配碱基法

包含生物大分子制备和分析常用技术、蛋白质与核酸的提取与分离、PCR技术、分子杂交与印迹技术、分子克隆技术、外源基因转移技术、蛋白质表达技术、分子标记技术、分子改造技术、测序及人工合成技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、生物芯片技术、生物信息学技术、RNA研究技术等。 作为一本实验技术类专著，此书不仅较详细地阐述了有关技术的具体操作和程序，更着力于对各种技术的基本原理及其相关理论基础进行深层次的剖析。故此书不仅可作为从事生命科学，特别是分子生物学相关领域工作者的实验室必备参考工具书，同时也可供高校相关专业师生及科学工作者对分子生物学实验技术的理论做深入探讨时参考。

随着生命科学和化学的不断发展，人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从单个的生物体到器官到组织到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构（如核酸序列），来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理（病理）状态的差异。这就为生物学和医学的各个领域，提供了一个强有力的技术平台。 基本介绍 中文名 ：分子生物学技术 种类 ：四种 套用 ：遗传性疾病的研究 研究对象 ：动植物 分类,套用, 分类 目前，常用的分子生物学技术有如下几种： PCR单链构象多态性分析 PCR- 单链构象多态性分析(PCR- single strand conformation *** ysis,PCR- SSCP) 是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。PCR- SSCP 技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变,通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。样品经PCR 扩增后，其产物经变性后可以产生2 条单链，如果存在基因突变，哪怕是一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 中，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR- SSCP 分析的主要优点是简易且敏感性较高。但是该技术不能确定突变的部位和性质。PCR- SSCP 突变检测敏感性随PCR 产物长度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE 电泳就可能无法检出，在PCR 产物或待测DNA 小于200 bp 时，PCR- SSCP 分析能够检测出70%~ 95%的突变。如果以毛细管电泳代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。 Wallace1997 年提出将PCR- SSCP 和异源DNA双链分析（heteroduplex *** ysis,HA) 相结合，称之为SSCP/ HA，部分PCR 产物经变性进行SSCP 分析以了解是否具有突变，其余PCR 产物直接用于电泳，以检出含有突变的异源DNA双链，电泳凝胶经银染，单链DNA所形成的带为橘黄或棕色，而双链DNA则表现为灰黑色。该综合手段可以单链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变，是一种经济、迅速的突变检测手段，但无法提供突变位置的信息。 PCR- SSCP 有许多改进技术，如RNA单链构象多态性法（PCR- rSSCP）、双脱氧测序单链片段构象多态分析（PCR- ddF）、限制酶指纹技术(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某类启动子，通过转录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴别。PCR- ddF 法把PCR 产物转录，将转录物用反转录酶进行Sanger 双脱氧终止测序反应，通过观察非变性胶上经解链处理所产生的单链漂移、突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR- REF 法将RFLP 和SSCP 技术优势组合，将PCR 扩增的待测片段用5~ 6 种限制酶依次消化，混合并进行末端标记，最后经变性处理并在非变性凝胶上电泳分离，从而获得来自片段长度和片段构象的双重突变信息。 变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的，该手段解析度达一个碱基。当DNA 双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度（Tm) 低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低，最容易解链，其次是富含AT 碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。将PCR 产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时，该片段低温解链部分的双链打开，部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE 敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE 方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp 以内可以达到95%。 DGGE 的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使试验无法检出存在于高Tm DNA片段中的碱基替换。为了解决此问题，可以在一个PCR 引物的5 " 端设计一段富含GC的尾巴，从而使PCR 扩增产物的一端富含GC 碱基对，保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE 的突变检出率接近100%，但DGGE 只能检测突变是否存在而不能确定突变的位置。 DGGE 方法需要设计特定片段最佳的PCR引物以及最佳变性条件，这一过程比较复杂，梯度变性胶的制备需要的设备较昂贵，所以在常规实验室不易实施。 双链构象多态分析法 双链构象多态分析（double- strand conformation *** ysis,DSCA) 是利用萤光标记引物，通过PCR 扩增出相关的研究片段作为萤光标记参照（fluorescence labeled reference,FLR)DNA分子。然后，用标记参照物FLR 分子与待测PCR扩增片段进行杂交。因为FLR 和样本核苷酸序列相似，杂交反应液中所有DNA的正链和反义链之间将形成双链结构。只有与带萤光标记的FLR 分子正链匹配的DNA双链，经过电泳后方可被DNA测序仪的雷射检测系统所检测。所以，可检双链均有一样的FLR 正链，杂交双链的电泳迁移率可能相同，但是由于反义单链的差异双链变性程度的差异而最终造成电泳迁移率的不同。不像SSCP 技术，DSCA能够任意操纵变性双链的形成，选用不同的FLR可以达到难分样本的最佳分离效果。另外，通过调整FLR 和样本待测DNA分子的比例，可专一性增强杂交异质双链信号并减弱纯合双链信号。DSCA技术的优点还在于它依据样品经过固定检测仪的时间差，而非相同电泳时间迁移的距离差来判断突变的有无，这样就避免了诸如SSCP 等技术分析中因迁移速率差异而降低的泳动速度慢的条带检测率。另一方面，DSCA的有效检测片段长度可达1 kb。由于雷射系统的介入，DSCA的灵敏度和上样量分别得以提高和降低，不到1 秒的泳动差异也足以检测。该技术已被成功地用于囊性纤维化基因（cystic fibrosis gene) 的4 种突变，以及HLA Ñ型基因中131 种等应基因的检测。 变性- 高压液相色谱分析 变性- 高压液相色谱(denaturing high- performance liquid chromatography,DHPLC) 是利用DNA构型改变检测基因突变和遗传多态性的方法之一，其可以检测单核苷酸多态和可遗传的突变。实验主要过程包括PCR 扩增待测和正常DNA样品，将扩增产物变性后再复性，若存在突变，在这一复性过程中可形成异源双链。在部分变性条件下，高压液相色谱分析可以有效地区分由变异碱基与正常碱基形成的异源DNA双链和正常DNA双链。由于DHPLC 的解析度可达到1bp/ kb，而且操作过程可以全部程式化、大规模化和自动化，使得实验时间大大缩短，实验准确率提高，可作为大群体任何基因突变初筛的有力手段，比SSCP 有更多的优越性，具有广泛的套用前景，许多工作都已经证实了DHPLC的敏感性、有效性和准确性。 特异性等位基因扩增 等位基因特异性扩增法（allele- specific amplificarion,ASA) 是基于PCR技术的一种单核苷酸突变检测法，是分析已知碱基替代或微小片段缺失和插入型突变的常规技术。在PCR 的引物设计中，根据已知突变位点性质在引物3 " 端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补而只扩增突变型或野生型基因。 ASA技术只需一步PCR反应，甚至无需电泳和标记技术。因其快速，重复性强，耗资少，无同位素污染以及高效性等特点，将成为有前途的适应于人群大规模突变筛查的方法。套用该方法最好避免错配碱基为G: T，这种错配可能引发扩增反应。 化学裂解错配碱基法 化学裂解错配碱基法（chemical cleavage mi *** atch,CCM) 通过化学修饰并切割异源DNA双链中错配碱基，达到检测点突变的目的。其原理是末端标记的DNA片段暴露于可以识别并修饰异源双链中错配碱基的化学试剂中（如错配的胞嘧啶可被羟胺修饰，错配的胸腺嘧啶可被四氧化锇修饰），被修饰的位点随即可被杂氮环已烷等化学物质裂解。DNA修饰裂解后，电泳观察DNA片段长度即可知道突变是否存在。该技术较其他突变检测系统有更多的优越性，可以扫描1~ 2 kb 的大片段DNA并在随后的顺序分析中定位突变位点，其效率可达100%。该手段通常首先对目标DNA和野生型DNA进行PCR 扩增，然后对野生型DNA扩增片段进行末端标记，标记片段作为探针与目标序列复性形成异源双链，用四氧化锇（OsO4） 或羟胺（hydroxylamine) 修饰并用哌啶（piperidine) 切割，聚丙烯酰胺电泳分离不同长度的片段。近年来，有人采用碳化二亚胺作为错配修饰剂，进一步提高了该方法的敏感性。CCM方法最初采用同位素DNA片段，用萤光标记代替同位素后，称之为萤光化学裂解错配碱基法（FCCM），该方法依然比较敏感并且安全，可检出95%~ 100%的错配。化学裂解错配碱基法的不足之处在于工作量大，需要使用有害化学物质作为试验用试剂。 套用 分子生物学技术：可套用于遗传性疾病的研究和病原体的检测及肿瘤的病因学、发病学、诊断和治疗等方面的研究提高到了基因分子水平。 生物学定义：生物学是研究生命现象和生物活动规律的科学。 据研究对象分为动物学、植物学、微生物学、古生物学等；依研究内容，分为分类学、解剖学、生理学、细胞学、分子生物学、遗传学、进化生物学、生态学等；从方法论分为实验生物学与系统生物学等体系。

【答案】：分子生物学是从生物化学发展而来的一门学科，从分子水平阐述生命现象和生物学规律。而分子生物学与植物病理学组成了一个新的学科 分子植物病理学，它应用分子生物学理论和DNA重组技术，研究植物病害的发生机制，阐明病程中寄主 病原物相互作用的分子基础，寄主、病原物与病程相关的基因及其结构、表达和调控机制。其在病害的生物防治上主要表现在以下几个方面。植物抗病基因工程：包括植物抗病毒、真菌、细菌基因工程。在植物病毒方面，利用生物技术，将编码植物病毒的外壳蛋白基因导入植物细胞中，并获得转基因植株。这些植株叶片细胞中有病毒外壳蛋白的积累，能够抑制侵染病毒的复制，从而减轻病毒的症状，或推迟病害的发生时间，从而保护了植物。同样在真菌、细菌的植物病害中，利用生物技术生产培育了很多抗病植物，从而减轻了病害的发生。工程菌的改造：利用生物技术，对某些生物防治菌株进行改造，对其具有抗病功能的目的基因进行鉴定和克隆、加工、重组、转化，从而使其抑菌谱加宽、抑菌能力增强等。内生菌的应用：许多学者认为，内生细菌是植物病害生物防治的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景，已在生物防治细菌性病害、真菌性病害和线虫病害方面发挥了巨大的作用。利用生物技术，可以将其抗病基因转入植物中，产生抗病性植株。蛋白质纯化技术：随着分子生物学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组学的系列分析来试图阐明生物防治菌的抗病机制是远远不够的，只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握其规律，而研究蛋白质的首要步骤就是分离纯化蛋白质。常用的技术有：凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱、共价色谱、电泳技术等。发酵工程：发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品。在生物防治方面，发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。酶工程技术：在生物防治方面，构建具有抗病功能的工程菌，应用基因重组技术将生物细胞中存在的极少的具有催化某一生化反应的酶通过基因扩增和增强表达，建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞，并进一步将其构建成固定化工程菌或固定化工程细胞。综上所述，分子生物学的发展带动了植物病理学的发展，在植物病害的防治上具有很好的应用前景。

分子生物学中有很多实验技术，但是其中最为重要的两项实验技术为PCR和蛋白质电泳。一、PCR技术。PCR技术全称为聚合酶链式反应，是一种通过体外繁殖DNA序列的方法。它利用聚合酶酶和引物，在反应体系中对DNA序列进行循环扩增，并且可以在很短时间内扩增出数以万计的特定DNA序列。PCR技术广泛应用于基因测序、DNA克隆、DNA指纹鉴定等领域，并为分子生物学的发展提供了强有力的工具。二、蛋白质电泳技术。蛋白质电泳技术是一种用于分离和鉴定蛋白质的方法。它利用电场将具有负电荷的蛋白质分子分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和两级电泳等不同方法进行蛋白质分离、检测和测量。蛋白质电泳广泛应用于蛋白质组学、生物医学研究和生命科学等领域，并做出了许多重要的发现。分子生物学的基本内容：一、蛋白质体系。蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。二、蛋白质分子结构。蛋白质分子结构的组织形式可分为4个主要的层次。一级结构，也叫化学结构，是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构，称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。三、分子生物学研究。蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系，这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。

分子生物学检验技术是以DNA、RNA或蛋白质为诊断材料，通过分析基因的存在、变异或表达，从而为疾病诊断提供更直接、更科学的信息的一门诊断技术学科。其内容包括：基因突变的检测，如可以通过基因测序后与正常的图谱进行比较，发觉是否有异常；另外也可通过PCR技术和DNA芯片技术进行相关研究。(1)基因定位，Southern杂交、原位杂交可应用于正常或异常染色体的基因定位、细胞或组织中基因表达位点的确定、病毒及其他病原体感染的检测。(2)基因表达异常的检测，如果基因结构变异、基因表达过程失调，则由于其决定的转录产物mRNA与蛋白质发生质与量的改变。如应用RT-PCR等进行mRNA定量。蛋白质类物质是相关基因表达的最终产物，可以通过对相关蛋白质的测定，了解相关基因的情况。(3)感染微生物的检测，应用PCR技术直接扩增病原体基因的保守序列。可以对大多数病原体感染作出明确的诊断、分型、分类或判断是否发生了基因整合。(4)法医学检测，因为人类基因组的特殊性，既存在人类共有的基因序列，可以进行种属的鉴定；另一方面，人类又具有型特异性基因，表现为个体与个体间几乎没有共同点。应用基因扩增技术，可以有效地进行个体间的区别。

是新一代临床检验诊断技术。分子生物学检验技术是分子生物学技术在临床检验诊断应用中发展起来的，以疾病为中心、以生物分子标志物为靶标的新一代临床检验诊断技术，是临床分子生物学的重要组成部分。分子生物学检验技术是医学检验的一个重要分支，它利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为疾病的预测、预防、诊治和转归提供分子水平信息。

1、现代分子生物学主要是从分子水平上阐述生命现象和本质的科学，是现代生命科学的“共同语言”。 2、分子生物学又是生命科学中进展迅速的前沿学科，它的理论和技术已经渗透到其他基础生物学科的各个领域，它的主要核心内容是通过生物的物质基础---核酸、蛋白、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用的运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探讨生命的奥秘。这门课与基因工程关系很大，主要讲了核酸、蛋白、酶等生物大分子的结构、功能以及它们之间的相互作用。

分子细胞生物学研究所用的实验技术有哪些分子诊断学的研究范畴包括：利用遗传学、病理学、免疫学、生物化学、基因组学、蛋白质组学和分子生物学的理论和方法探讨疾病发生和发展的分子机制。为整个疾病过程寻求特异的分子诊断指标，以及利用分子生物学技术为这些分子诊断指标建立临床实用的检测方法。细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。

生命现象的科学，它以核酸、蛋白质、多糖等生物大分 子结构、功能与生物分子间相互作用为研究核心，其 理论与技术已渗透到生命科学诸多领域。尤其是遗 传、进化、发育、神经及免疫等。医学分子生物学即 用分子生物学的理论与技术研究医学，它在分子水 平上认识生命的正常状态及其变异规律。研究新陈 代谢的调节与失控特点。对生命现象正常状态的研 究属于基础研究；对变异规律与失控特点的探讨，对 疾病的病因、发生、发展及转归的分子机理的研究属 于应用基础研究，医学分子生物学的基础研究与应 用基础都是探讨生命现象的运动规律。如何将医学 分子生物学的理论与技术用于临床诊断与治疗，则 属于应用研究的范畴。倒如用基因分析技术对一些 遗传病做产前诊断，用基因工程方法研制出一些高 效的药物如干扰素、红细胞生成素等，特别是近年来 许多国家投人大量人力财力进行人类基因组研究工 作，使人们产生一个错觉，以为找到基因就能认识生 命现象，诊断治疗也就迎刃而解，错误地认为分子生 物学只是研究核酸、基因。追溯分子生物学的诞生， Weaver于1938年在洛克菲勒基金董事会上首次指 出这是一个新的颁域，即“应用精细的现代技术来研 究某些生命过程的徽小细节”，“揭示有关细胞最小 单位的奥秘”，第一次运用了分子生物学这个名词， 并明确了研究目的。60年来从分子水平认识生命 现象的研究包括3大方面，即生物太分子（包括核 酸、蛋白质等）的结构与功能，生物膜的结构与功能， 生物信息（包括细胞内外及遗传信息薄）的传递通路 与调控。基因研究是十分重要且进展最快影响较大 的一部分，但不是分子生物学的全部。医学分子生 物学只有通过多方位、多途径的研究才能最终更深 人地了解健康与疾病，创造出更有教的诊治方法。 2．2科学认识医学分子生物学中的新发现 临床医师对一个新学科的出现总是希望能尽多 尽快地藉以解决一些赣宋风题，担是，分子生访学中 的新发现甩于临床要有一个过程。而且往往要经过 比较漫长的道路。倒如．从发现一个关健基因到能 进行相应的基因治疗，决非易事。因为基因导人细 胞后能否持续高效表达、能否产生较高活性的产物， 这种细胞在体内能存活多久．都是决定基因治疗成 败的重要因素。难怪若干年前即有多种基因治疗的 方案，但真正成功的，至今仍然寥塞无几。然而，一 旦摸索出一些规律，掌握了技术关健．涌现出一批新 的基因治疗还是有可能的，只是需要假以时日。1人 类基因组工作也属类似情况，在1998年世界卫生大 会报告中称这项计划是开创性的，“将使侧重疾病的 诊治转向预报或早期发现，使疾病在症状发作之前 即被控制”，“可更精确地设计药物”，“具有创造巨大 效益的潜力”。诚然，这是一项庞大的有长远意义的 工作，发现一个与疾病紧密相关的基因，得知其基因 产物及其作用，有利于了解发病机制、有助于诊断及 有可能针对生物大分子的结构设计药物，也有助于 预防。然而，人体是十分复杂的，大多数疾病是多因 素多步骤的结果。因此，将人类基因组计划的成果 用于临床实践，将是伟大的、具有无限前景的，但不是 临床医生所期望的那样短期内可以获得的。而临床 医师也不要因此认为分子生物学的研究与解决实际 问题相距遥远，因为诸如细胞因子的发现。利用基因 工程技术生产一些有较强活性的造血细胞因子，从而 使一些病症得到有效治疗，就是近年的成功范侧。 另外，百度文库也有详细说明：http://wenku.baidu.com/view/bde63142b307e87101f696ca.html

PCR分子克隆核酸电泳、琼脂糖凝胶电泳测序DNA,RNA 提取转化外源DNA体外转录、逆转录cDNA文库构建原位杂交、酵母双杂交、差减杂交、扣除杂交蓝白斑筛选、抗生素筛选 基因工程技术大部分都是依据分子生物学原理设计出来的.

生命现象的科学，它以核酸、蛋白质、多糖等生物大分子结构、功能与生物分子间相互作用为研究核心，其理论与技术已渗透到生命科学诸多领域。尤其是遗传、进化、发育、神经及免疫等。医学分子生物学即用分子生物学的理论与技术研究医学，它在分子水平上认识生命的正常状态及其变异规律。研究新陈代谢的调节与失控特点。对生命现象正常状态的研究属于基础研究；对变异规律与失控特点的探讨，对疾病的病因、发生、发展及转归的分子机理的研究属于应用基础研究，医学分子生物学的基础研究与应用基础都是探讨生命现象的运动规律。如何将医学分子生物学的理论与技术用于临床诊断与治疗，则属于应用研究的范畴。倒如用基因分析技术对一些遗传病做产前诊断，用基因工程方法研制出一些高效的药物如干扰素、红细胞生成素等，特别是近年来许多国家投人大量人力财力进行人类基因组研究工作，使人们产生一个错觉，以为找到基因就能认识生命现象，诊断治疗也就迎刃而解，错误地认为分子生物学只是研究核酸、基因。追溯分子生物学的诞生，Weaver于1938年在洛克菲勒基金董事会上首次指出这是一个新的颁域，即“应用精细的现代技术来研究某些生命过程的徽小细节”，“揭示有关细胞最小单位的奥秘”，第一次运用了分子生物学这个名词，并明确了研究目的。60年来从分子水平认识生命现象的研究包括3大方面，即生物太分子（包括核酸、蛋白质等）的结构与功能，生物膜的结构与功能，生物信息（包括细胞内外及遗传信息薄）的传递通路与调控。基因研究是十分重要且进展最快影响较大的一部分，但不是分子生物学的全部。医学分子生物学只有通过多方位、多途径的研究才能最终更深人地了解健康与疾病，创造出更有教的诊治方法。2．2科学认识医学分子生物学中的新发现临床医师对一个新学科的出现总是希望能尽多尽快地藉以解决一些赣宋风题，担是，分子生访学中的新发现甩于临床要有一个过程。而且往往要经过比较漫长的道路。倒如．从发现一个关健基因到能进行相应的基因治疗，决非易事。因为基因导人细胞后能否持续高效表达、能否产生较高活性的产物，这种细胞在体内能存活多久．都是决定基因治疗成败的重要因素。难怪若干年前即有多种基因治疗的方案，但真正成功的，至今仍然寥塞无几。然而，一旦摸索出一些规律，掌握了技术关健．涌现出一批新的基因治疗还是有可能的，只是需要假以时日。1人类基因组工作也属类似情况，在1998年世界卫生大会报告中称这项计划是开创性的，“将使侧重疾病的诊治转向预报或早期发现，使疾病在症状发作之前即被控制”，“可更精确地设计药物”，“具有创造巨大效益的潜力”。诚然，这是一项庞大的有长远意义的工作，发现一个与疾病紧密相关的基因，得知其基因产物及其作用，有利于了解发病机制、有助于诊断及有可能针对生物大分子的结构设计药物，也有助于预防。然而，人体是十分复杂的，大多数疾病是多因素多步骤的结果。因此，将人类基因组计划的成果用于临床实践，将是伟大的、具有无限前景的，但不是临床医生所期望的那样短期内可以获得的。而临床医师也不要因此认为分子生物学的研究与解决实际问题相距遥远，因为诸如细胞因子的发现。利用基因工程技术生产一些有较强活性的造血细胞因子，从而使一些病症得到有效治疗，就是近年的成功范侧。另外，百度文库也有详细说明：

分子生物学技术：可应用于遗传性疾病的研究和病原体的检测及肿瘤的病因学、发病学、诊断和治疗等方面的研究提高到了基因分子水平。生物学定义：生物学是研究生命现象和生物活动规律的科学。据研究对象分为动物学、植物学、微生物学、古生物学等；依研究内容，分为分类学、解剖学、生理学、细胞学、分子生物学、遗传学、进化生物学、生态学等；从方法论分为实验生物学与系统生物学等体系。

首先，基因表达是基因转录和翻译的过程，大多数基因表达都经历“转录→翻译→蛋白质”的过程，因此研究基因表达就是检测mRNA和蛋白质。DNA印迹，是通过杂交检测DNA的缺失、插入的方法；RNA印迹和反转录PCR分别通过杂交、逆转录和PCR检测mRNA的方法；Weasten印迹，是通过杂交蛋白质的方法。所以常用的基因表达分子生物学技术有：RNA印迹和反转录PCR，Weasten印迹。

分子生物学技术在医学中的主要应用有：疾病诊断，生物工程与生物制药。详见百度文库：http://wenku.baidu.com/view/be28810e6c85ec3a87c2c518.html

相比于免疫学检测，分子生物学检测灵敏度和特异性均显著提高，缺点是耗时较长，对实验设备及检测人员能力要求较高。分子生物学技术有着时效性短、灵敏度高、特异性强等优势，能够有效地应用于致病菌的快速检测。微生物检测的意义随着社会的高速发展 ,分子生物学的技术成果已经显示出了其强大的优势。例如工模拟酶，并生成新的催化剂,领导了化学工业的新革命。除此之外，分子生物学技术不仅可以应用到化学方面，还可以应用于饲料的微生物检测，在很大程度上能够保证饲料安全和人类健康。通常情况下，在饲料的生产、加工、运输过程中极易被微生物感染。为了防止其污染，通常在饲料中加入防腐剂、防霉剂，但是保鲜效果并不是很明显。饲料一旦受到微生物污染营养价值就会降低，还会危害微生物健康。动物在食用了霉变的饲料后，很容易生病或者死亡，造成经济损失。

《分子生物学实验技术》本书是关于分子生物学实验技术的一部综合性著作。它全面覆盖了有关分子生物学实验技术的诸多领域，包含了生物大分子制备和分析常用技术、蛋白质与核酸的提取与分离、PCR技术、分子杂交与印迹技术、分子克隆技术、外源基因转移技术、蛋白质表达技术、分子标记技术、分子改造技术、测序及人工合成技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、生物芯片技术、生物信息学技术、RNA研究技术等。

嘿嘿这个有点难了

本书是关于分子生物学实验技术的一部综合性著作。它全面覆盖了有关分子生物学实验技术的诸多领域，包含了生物大分子制备和分析常用技术、蛋白质与核酸的提取与分离、PCR技术、分子杂交与印迹技术、分子克隆技术、外源基因转移技术、蛋白质表达技术、分子标记技术、分子改造技术、测序及人工合成技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、生物芯片技术、生物信息学技术、RNA研究技术等。

随着对大量分子标记技术（如RFLP、AFLP、RAPD和微卫星等）的利用，已经可以进行杂种鉴定，叶绿体DNA和线粒体DNA的特异性限制性图谱已经用于鉴定体细胞杂种。这些是基于DNA基础上比较准确的分析方法，不会受到环境因素的影响，如RFLP标记、PCR技术已被用于马铃薯和番茄体细胞杂种的鉴定。值得注意的是体细胞杂交尚存在一些问题：亲缘关系越远，染色体排斥丢失的现象就越严重；由于是两个物种的全部遗传物质的合并，各种基因都在其中，选择符合需要的个体难度大；有时缺乏选择杂种细胞的有效方法。因此目前整体对称融合的工作比较少，而是采用非对称融合，即一方亲本包括了全部遗传物质，另一方亲本只取一部分遗传物质，如用不具有核的原生质体与之进行融合。

免疫化学实验包括免疫血清的制备、沉淀反应定量法、对流免疫电泳、单向定量免疫电泳（火箭电泳）、双向定量免疫电泳（交叉免疫电泳）、微量免疫电泳以及单向双向免疫扩散、酶联免疫吸附测定等。免疫电泳法（immunoelectrophoresis）在凝胶介质中将电泳法与扩散法相结合的一种免疫化学方法，用以研究抗原和抗体。酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）或免疫酶技术（immunoenzymatic technique）是指用酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它采用抗原与抗体的特异反应与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。目前常用的方法称为酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。酶免疫测定技术还包括生物素―亲和素系统（biotin-avidin system, BAS），均相酶免疫测定法（homogeneous enzyme immunoassay, HEI）等。免疫标记技术中还有免疫荧光技术（immunofluorescence technique），放射免疫测定（radioimmunoassay, RIA）和发光免疫测定（luminescent immunoassay, LIA）等。免疫印迹或免疫转印技术（immunoblotting或Western blot）已广泛应用于分子生物学和医学领域，成为免疫学、微生物学及其它生命科学常用的一种重要研究方法。流式细胞术、免疫组化、蛋白质芯片、免疫共沉淀等，在分子生物学方面的应用也越来越广泛。

并不了解，这是一个比较专业的东西，对于这一方面没有多少了解。

什么是现代分子生物学技术《现代分子生物学》是1997年高等教育出版社出版的图书，作者是朱玉贤，李毅，郑晓峰。《十二五普通高等教育本科国家级规划教材:现代分子生物学(第4版)》由朱玉贤等编著，高等教育出版社出版。《十二五普通高等教育本科国家级规划教材:现代分子生物学(第4版)》可供全国高等院校生物科学和生物技术专业的教师和学生使用，也可作为相关专业研究人员的参考书。

起始复合物的形成取决于几个起始因子的作用。在原核生物中，存在着三个起始因子（Initiation Factor 缩写为IF）IF－1，IF－2和IF－3。IF－1结合在30S核糖体亚基上，促进IF－2和IF－3发挥作用。IF－3的一个作用是通过结合在30S的小亚基上，使小亚基维持在游离的状态，IF－3与30S的结合可以防止30S和50S亚基形成排斥mRNA的不成熟的70S复合物。它对mRNA上的转录起始位置具有很高的亲和性。结合了GTP的IF-2-GTP复合物可以特异识别起始tRNA，就是说，能够从细胞中的氨酰化的tRNA分子库中挑选出fMet- tRNAfMet。IF-2-GTP结合在30S亚基上，通过形成的30S复合物识别mRNA模板上的SD序列和起始密码，与mRNA相互作用，形成了一个由fMet- tRNAfMet、IF-2-GTP以及mRNA组成的前起始复合物。一旦形成前起始复合物，50S亚基就与30S亚基结合，同时结合在IF－2上的GTP水解生成IF-2-GDP和Pi，然后结合在前起始复合体上的起始因子IF－1和IF－3解离，最后形成由30S与50S组成的起始复合物，fMet- tRNAfMet被定位在P位。IF-2-GDP 中的GDP与GTP交换重新生成IF-2-GTP。

肥料是作物的“粮食”，化肥和平衡施肥技术的出现是第一次农业技术革命的产物和重要特征。但由于化肥施用不当和施用过量不但造成浪费，而且导致环境污染和农产品品质下降，严重地影响人们的身体健康，如何提高化肥利用率和减少环境污染已成为当今重大课题，也是当今农业新技术革命应解决的难题。植物营养基因型差异和植物营养遗传特性的解析为进一步提高化肥利用率，减少资源消耗，改善农业环境质量提供了新途径和新方法。植物营养遗传特性的一般性表现有：逆境条件下耐性植物的自然分布、常见作物的需肥特点、同一作物不同品种的需肥特点、某些植物对营养物质的特殊需要等。植物营养遗传特性在外部形态上的特征主要有：茎的粗细、叶片的数量和大小、根的形态特征（根的形态类型——直根系和须根系、根重、根长、根表面积、根密度、根尖数量、根毛等）。植物营养遗传特性的生理生化基础主要包括以下几方面：生长速率、对营养物质吸收的选择性、植物营养的阶段性（营养临界期和最大效率期）、根系的阳离子交换量、有关酶的活性、植物内源激素的水平以及植物毒素等。DNA双螺旋模型和中心法则的提出，明确了遗传信息传递的规律，从而使分子生物学有了迅猛的发展，逐渐成为生命科学中最具活力的学科。分子生物学与其他学科的结合及分子生物学技术的广泛应用，不仅拓宽了研究领域，而且使我们对分子水平上生命现象和生物学规律的认识更加深入。分子生物学技术包括分子克隆、细胞融合、杂交瘤技术、突变体筛选等，这里主要介绍目前较多应用于植物营养遗传特性研究中的几种分子标记技术。遗传标记技术的发展自19世纪中期产生，经历了形态学标记、细胞学标记两个阶段。1991年Orodzicker等第一次利用DNA限制性片段长度多态性（restictivefragmentlengthpolymorphism，RFLP）进行腺病毒血清型突变体基因组作图，使遗传标记技术最终突破表达基因的范围而进入分子水平，并随之发展了AFLP、RAPD、SSLP、STS等一系列分子标记技术。这些技术为遗传图谱的构建，及建立在此基础上的基因克隆、辅助选择提供了重要手段。

总览该课程可让你获得的技能将包括书面和口头陈述技能，统计数据以及计划和编写赠款申请或商业计划的能力。特定于学科的技能将包括分子生物技术中使用的关键技术，该学科的理论和实践方面的专业知识，包括：过程工程，分子生物学，功能基因组学，“组学”技术，蛋白质表达系统和抗体工程。实践技能将包括发酵，分子生物学，免疫学，细胞生物学和蛋白质化学。课程：课程（所有核心）如下：生物技术概论：从基因到产品分子生物技术研究技术分子生物技术的实际应用功能基因组学和反向遗传学资助和交流科学从平台到市场的药物和治疗生物学研究项目通过讲座，讲习班，独立研究，实验室实践，研究和基于实验室的项目进行学与教。分子生物技术专业理学硕士的课程说明生物技术概论：从基因到产品分子生物技术研究技术分子生物技术的实际应用从平台到市场的药物和治疗生物学资助和交流科学功能基因组学和反向遗传学向分子生物学技术硕士学生提供的最新项目名称示例核被膜在植物减数分裂中控制减数分裂进程和减数分裂重组的作用甘蓝和相关多倍体的减数分裂进程植物中3D细胞形状变化的计算分析使用CRISPR‐Cas9标记酵母中的基因细菌中的启动子组织鉴定与苔藓孢子有关的细菌种类用于蛋白质分析的液体萃取表面分析质谱仪的开发精氨酸甲基化如何调节癌症中的转录因子c-MYC？工程化M13噬菌体以产生新的纳米结构自清洁表面：防止感染蔓延开发和优化用于液相色谱-质谱代谢组学数据采集和处理的工作流程烧伤创伤中的败血症和其他临床结局：运用新陈代谢了解败血症和临床结局在不同的人体样本（生物流体和组织）中，新陈代谢有何不同？鉴定和表征新型调节剂，可调节程序性细胞死亡和组织恢复控制拟南芥减数分裂重组：染色体轴的作用探索假酶EchA6在霉菌酸合成中的作用新型基因组不稳定性突变的研究N末端乙酰化是植物蛋白质降解的信号Burkitt淋巴瘤的细胞应答和对组蛋白脱乙酰基酶抑制剂治疗的抗性分析成瘾于FGFR信号的人乳腺癌细胞的磷酸化蛋白质组学数据集MCL1在乳腺癌细胞存活中的作用大肠杆菌的重要基因内景观铜绿假单胞菌中每个基因的全局测定使用CRISPR技术生成参与神经系统发育的突变体鉴定海洋沉积物中的新型抗肿瘤药调查大肠杆菌中蛋白质分泌的机制分配蛋白KorB和IncC与DNA和其他蛋白伴侣的相互作用转录速率变异性和基因调控网络动力学新型非编码RNA在穿梭调节蛋白中的作用探索桥粒桥蛋白接头结构域的结构探索革兰氏阴性细菌外膜蛋白折叠机制Bam复合物的结构和功能大肠杆菌中脂质逆行转运使用新方法纯化膜蛋白复合物走向神经退行性蛋白质Cln3的结构基于个体的生物膜建模携带抗药性的质粒在空间结构多物种群落中的转移高通量测定微流体装置中的底物亲和力细菌中的基因调控结构：细菌捕食者Bdellovibrio细菌的潜在自我保护蛋白的功能研究了解大肠杆菌的pH感应机制了解实验室进化的抗逆细菌菌株中基因型和表型之间的联系实验室条件下细菌在发酵条件下产生的抗逆菌株的行为

分子生物学是在分子水平上研究生命活动的生物学，研究对象很多，既包括常见的DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的活动规律，也研究各种生物体内小分子物质对于生命活动的影响（比如许多信号分子，如激素等的作用模式）。基因工程指的是在分子生物学的基础之上对生物体内的基因进行改造（可以增加、减少或是修饰等），通过这种改造来达到人类希望的目的，比如转基因抗虫棉，基因靶向治疗等都属于基因工程的范畴。DNA重组技术指的是通过种种分子生物学手段将生物体内的DNA进行重组（比如插入新的基因，对原有基因进行改造等）的方法，是分子生物学中常用的一种研究技术。参考资料：http://baike.baidu.com/link?url=L1PgbNEf-b9vkAimtkQLlKUloiFywEE2D3e1ElundJ_fgp_ZeGXAGI8cBb--iImh92HmWg0ocsg8YdCdezJ5Unk8BCJpHDrUYXN1W9JRh0y

没什么前景的。生物就业不行。主要是生物在国内发展得不够。如果可以出国的话，生物还是一个比较好的选择。

几种重要的PCR衍生技术（一）逆转录PCR技术 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 （二）原位PCR技术原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 （三）实时PCR技术实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。

一、RNA干扰技术1.RNA干扰技术能高效特异地阻断基因的表达，已成为研究蛋白质及其基因功能、细胞信号传导途径、基因治疗和药物开发的理想手段。2.微RNA与检验医学网生物体阶段性发育密切相关，可以使特异基因在翻译水平受到抑制，在细胞生长和凋亡、血细胞分化、胚胎后期发育等过程中发挥重要作用，还可能与肿瘤发生有关。二、生物芯片1.生物芯片特点：高通量、微型化和自动化，能将生命科学研究中的许多不连续过程集成于一体。2.生物芯片必将在基因功能研究、基因诊断、药物筛选和个体化药物治疗等方面扮演重要角色，具有重大的应用潜力。三、蛋白质组学当今的研究重点已经开始从揭示生命的遗传信息过渡到对生命活动的直接执行者——蛋白质进行整体水平的研究，蛋白质组学正成为目前揭示生命规律的新的重大热点领域。

PCR技术也叫聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。PCR技术的原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5"-3")的方向合成互补链。

基 础 篇实验1 碱法提取质粒实验2 煮沸法提取质粒实验3 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳实验4 质粒的限制性内切酶反应分析实验5 用玻璃奶回收琼脂糖凝胶中的DNA实验6 DNA的连接实验7 E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化实验8 植物总RNA的提取实验9 聚合酶链反应——PCR实验10 CDNA末端快速扩增——RACE实验11 高通量基因克隆技术实验12 银染法DNA序列测定应 用 篇实验13 原核细胞中外源基因的表达和初步纯化实验14 蛋白质的SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳实验15 昆虫细胞中外源基因的表达实验16 蛋白质的Weatern印迹分析实验17 土壤农杆菌介导的烟草基因转化实验18 应用微弹轰击法进行兰花基因转化实验19 植物总DNA的提取实验20 DNA探针的制备实验21 DNA的Southern印迹分析(用同位素标记探针)实验22 DNA的Southern印迹分析(用Dig标记探针)实验23 mRNA的Northern印迹分析(用Dig标记探针)实验24 酵母双杂系统研究蛋白质的相互作用实验25 CytoTrap酵母双杂系统研究蛋白质的相互作用实验26 DNA一蛋白质的相互作用实验27 蛋白质核酸结合活性的分析实验28 以烟草脆裂病毒为载体通过基因沉默分析植物基因功能实验29 水稻突变体库的创建实验30 转基因水稻突变体T—DNA侧翼序列的扩增与分析探 索 篇实验31 亚克隆及检测的独立设计与操作实验32 土壤农杆菌感受态细胞的制备和转化实验33 不同植物材料组织的再生培养实验34 在酵母细胞中表达外源基因实验35 应用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达蛋白实验36 检测蛋白质的相互作用——Protein Overlay实验37 沉默转G US基因烟草中的GUS基因实验38 拟南芥T—DNA突变库的构建实验39 用RNAi的方法研究拟南芥基因功能主要参考资料

在动植物检验检疫中有哪些常用的免疫血清学技术和分子生物学技术分子诊断学的研究范畴包括：利用遗传学、病理学、免疫学、生物化学、基因组学、蛋白质组学和分子生物学的理论和方法探讨疾病发生和发展的分子机制。为整个疾病过程寻求特异的分子诊断指标，以及利用分子生物学技术为这些分子诊断指标建立临床实用的检测方法。又称血清学反应，抗原与抗体在体内体外均发生特异性结合，因抗体来源与血清，在体外进行抗原抗体反应，包括凝集反应、标记抗体技术、有补体参与的反应中和反应等

好难啊..............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

一般来说，生化与分子专业名字很宽泛，研究生期间可能相关的方向有：1.分子生物学相关，主要从事重组蛋白或其他的基因工程生物的构建，此外还有生物信息学方向的；2.发酵工程方向，主要从事菌种的筛选和培养优化；3.蛋白质工程方向，主要从事重组蛋白的表达、纯化与应用，包括酶、单抗和其他蛋白药物等；4.生物传感器等；5.动植物转基因，基因组学等；6.其他。就业的话，可以就近选择与自己课题相关的：1.分子方向的可以选择的行业最广，生物相关的行业基本都需要做分子构建的，大体分为大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞表达体系几种。推荐做哺乳动物表达体系，技术含量最高；生物信息学方向收入比较高，也比较好就业，还可以转程序员；2.发酵工程方向的可以做各种细胞筛选和培养的工作，包括目标是菌体的行业，和目标是表达产物的大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞表达体系几种。推荐做推荐做哺乳动物表达体系，技术含量最高；3.蛋白质工程方向可以做细胞培养和产物纯化应用相关的，包括大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞表达体系几种。推荐做推荐做哺乳动物表达体系，真核蛋白、单抗等技术含量最高；还可以做分析，包括跑液相为主的理化和更为复杂的（如测酶活，ELISA，Cell-base Assay的测活性）理化，以及QC相关的（如微生物限度，内毒素和环境控制），比较清闲，适合女生；4.其他几种方向的，就业方向是比较窄的，但是也可以从事上述的几个行业，公司招人的时候只要你的专业是生化与分子，一般不会纠结你的方向是什么，只要你能把自己做的东西讲清楚，一般就能通过面试；5.此外，特别优秀的硕士和博士还可以做项目经理（PM），对各个方向都有一定的了解之后可以做统筹管理和沟通客户的工作，这个要求最高；6.事业单位不了解，就不回答了。综上所述，生物制药行业，尤其是真核蛋白（CHO细胞）体系是大部分生化与分子专业的最好去处。

最典型的就是PCR，也就是聚合酶链式反应，在体外的DNA大量合成过程。反应程序分为预变性、【变性、退火（复性）、延伸】、延伸。【】之间的三步循环进行，也是DNA大量扩增的步骤。通过高温变性打开DNA双链结构，之后降低到一定温度使引物片段与DNA单链特异性结合也就是复性，之后通过聚合酶复制DNA，如此循环扩增。

总览通过以研究为中心的培训，你将开发计划和开展自己的实验的技能，通过分子生物学和生物技术实验性地解决科学问题。掌握了最新的分子生物科学技术后，你就可以将这些技能应用于你的研究项目。在这里，你将花费多达六个月的时间，在该领域的专家的监督下，研究与你的未来职业理想相匹配的分子生物学或生物技术领域。主题可能包括分子生物学，植物生物技术，工业生物技术或代谢工程。核心课程Laboratory Techniques in Molecular Biology 分子生物学实验室技术（30学分）Research Project 研究项目（60学分）可能的研究项目包括：细胞周期调节；植物基因工程；研究mRNA加工；分子细胞生物学和影像学；疾病治疗的免疫学方法；结构生物学（例如X射线晶体学）；从微藻类生产生物燃料和其他有用产品；通过基因工程技术的生物技术，例如极端微生物的下一代工业生物技术（NGIB）；酵母工程，以增强乙醇发酵；大肠杆菌的代谢工程。Advanced Research Topics 高级研究主题（15学分）Literature Review 文献评论（15学分）Cellular System Engineering for Biotechnology 生物技术蜂窝系统工程（15学分）可选择三个讲座课程：Advanced Bioprocess Design Project 高级生物工艺设计项目（15个学分）*Advanced Biochemical Engineering 高级生化工程（15学分）*The Microbiology of Extreme Environments 极端环境微生物学（15学分）Plant Biotechnology 植物生物技术（15学分）The RNA World RNA世界（15学分）

20世纪40-60年代，分子生物学上的三大发现为基因工程的诞生奠定了理论基础。一是40年代Avery等人通过肺炎球菌转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌，这一发现被誉为现代生物科学的开端，也是基因工程技术的理论先导；二是50年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理，确立了核酸作为信息分子的物质和结构基础，提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础；三是60年代关于遗传信息中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质的方向进行传递的。Avery等人关于DNA是遗传物质的发现和遗传信息中心法则的阐述，表明决定生物体具有不同性状的关键物质——蛋白质分子的产生是由生物体中DNA所决定的，可以通过对DNA分子的修饰改造改变生物的性状，根据DNA半保留复制的机理、对DNA分子的修饰改造可以通过DNA的复制进行传递，因此，三大理论的发现为基因工程技术的诞生奠定了理论基础。

提取基因组DNA，质粒提取，PCR，电泳，胶回收，酶切，连接，大肠杆菌转化，真菌转化（原生质体或ATMT转化），SOURTHERN BLOT，NORTHERN BLOT等等

目前，常用的分子生物学技术有如下几种 ： PCR- 单链构象多态性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。PCR- SSCP 技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变,通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。样品经PCR 扩增后，其产物经变性后可以产生2 条单链，如果存在基因突变，哪怕是一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 中，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR- SSCP 分析的主要优点是简易且敏感性较高。但是该技术不能确定突变的部位和性质。PCR- SSCP 突变检测敏感性随PCR 产物长度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE 电泳就可能无法检出，在PCR 产物或待测DNA 小于200 bp 时，PCR- SSCP 分析能够检测出70%~ 95%的突变。如果以毛细管电泳代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。Wallace1997 年提出将PCR- SSCP 和异源DNA双链分析（heteroduplex analysis,HA) 相结合，称之为SSCP/ HA，部分PCR 产物经变性进行SSCP 分析以了解是否具有突变，其余PCR 产物直接用于电泳，以检出含有突变的异源DNA双链，电泳凝胶经银染，单链DNA所形成的带为橘黄或棕色，而双链DNA则表现为灰黑色。该综合手段可以单链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变，是一种经济、迅速的突变检测手段，但无法提供突变位置的信息。PCR- SSCP 有许多改进技术，如RNA单链构象多态性法（PCR- rSSCP）、双脱氧测序单链片段构象多态分析（PCR- ddF）、限制酶指纹技术(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某类启动子，通过转录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴别。PCR- ddF 法把PCR 产物转录，将转录物用反转录酶进行Sanger 双脱氧终止测序反应，通过观察非变性胶上经解链处理所产生的单链漂移、突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR- REF 法将RFLP 和SSCP 技术优势组合，将PCR 扩增的待测片段用5~ 6 种限制酶依次消化，混合并进行末端标记，最后经变性处理并在非变性凝胶上电泳分离，从而获得来自片段长度和片段构象的双重突变信息。 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的，该手段分辨率达一个碱基。当DNA 双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度（Tm) 低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低，最容易解链，其次是富含AT 碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。将PCR 产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时，该片段低温解链部分的双链打开，部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE 敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE 方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp 以内可以达到95%。DGGE 的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使试验无法检出存在于高Tm DNA片段中的碱基替换。为了解决此问题，可以在一个PCR 引物的5 " 端设计一段富含GC的尾巴，从而使PCR 扩增产物的一端富含GC 碱基对，保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE 的突变检出率接近100%，但DGGE 只能检测突变是否存在而不能确定突变的位置。DGGE 方法需要设计特定片段最佳的PCR引物以及最佳变性条件，这一过程比较复杂，梯度变性胶的制备需要的设备较昂贵，所以在常规实验室不易实施。 等位基因特异性扩增法（allele- specific amplificarion,ASA) 是基于PCR技术的一种单核苷酸突变检测法，是分析已知碱基替代或微小片段缺失和插入型突变的常规技术。在PCR 的引物设计中，根据已知突变位点性质在引物3 " 端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补而只扩增突变型或野生型基因。ASA技术只需一步PCR反应，甚至无需电泳和标记技术。因其快速，重复性强，耗资少，无同位素污染以及高效性等特点，将成为有前途的适应于人群大规模突变筛查的方法。应用该方法最好避免错配碱基为G: T，这种错配可能引发扩增反应。 化学裂解错配碱基法（chemical cleavage mismatch,CCM) 通过化学修饰并切割异源DNA双链中错配碱基，达到检测点突变的目的。其原理是末端标记的DNA片段暴露于可以识别并修饰异源双链中错配碱基的化学试剂中（如错配的胞嘧啶可被羟胺修饰，错配的胸腺嘧啶可被四氧化锇修饰），被修饰的位点随即可被杂氮环已烷等化学物质裂解。DNA修饰裂解后，电泳观察DNA片段长度即可知道突变是否存在。该技术较其他突变检测系统有更多的优越性，可以扫描1~ 2 kb 的大片段DNA并在随后的顺序分析中定位突变位点，其效率可达100%。该手段通常首先对目标DNA和野生型DNA进行PCR 扩增，然后对野生型DNA扩增片段进行末端标记，标记片段作为探针与目标序列复性形成异源双链，用四氧化锇（OsO4） 或羟胺（hydroxylamine) 修饰并用哌啶（piperidine) 切割，聚丙烯酰胺电泳分离不同长度的片段。近年来，有人采用碳化二亚胺作为错配修饰剂，进一步提高了该方法的敏感性。CCM方法最初采用同位素DNA片段，用荧光标记代替同位素后，称之为荧光化学裂解错配碱基法（FCCM），该方法依然比较敏感并且安全，可检出95%~ 100%的错配。化学裂解错配碱基法的不足之处在于工作量大，需要使用有害化学物质作为试验用试剂。

随着生命科学和化学的不断发展，人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从单个的生物体到器官到组织到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构（如核酸序列），来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理（病理）状态的差异。这就为生物学和医学的各个领域，提供了一个强有力的技术平台。分子生物学技术：可应用于遗传性疾病的研究和病原体的检测及肿瘤的病因学、发病学、诊断和治疗等方面的研究提高到了基因分子水平。生物学定义：生物学是研究生命现象和生物活动规律的科学。据研究对象分为动物学、植物学、微生物学、古生物学等；依研究内容，分为分类学、解剖学、生理学、细胞学、分子生物学、遗传学、进化生物学、生态学等；从方法论分为实验生物学与系统生物学等体系。

分子生物学技术：可应用于遗传性疾病的研究和病原体的检测及肿瘤的病因学、发病学、诊断和治疗等方面的研究提高到了基因分子水平。生物学定义：生物学是研究生命现象和生物活动规律的科学。据研究对象分为动物学、植物学、微生物学、古生物学等；依研究内容，分为分类学、解剖学、生理学、细胞学、分子生物学、遗传学、进化生物学、生态学等；从方法论分为实验生物学与系统生物学等体系。

分子生物学的基本含义分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、 生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。二、分子生物学发展简史分子生物学的发展大致可分为两个阶段。1、准备和酝酿阶段19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：确定了蛋白质是生命的主要基础物质19世纪末Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名称，酶是生物催化剂。20世纪20-40年代提纯和结晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黄酶、细胞色素C、肌动蛋白等），证明酶的本质是蛋白质。随后陆续发现生命的许多基本现象（物质代谢、能量代谢、消化、呼吸、运动等）都与酶和蛋白质相联系，可以用提纯的酶或蛋白质在体外实验中重复出来。确定了生物遗传的物质基础是DNA虽然1868年F.Miescher就发现了核素（nuclein），但是在此后的半个多世纪中并未引起重视。20世纪20-30年代已确认自然界有DNA和RNA两类核酸，并阐明了核苷酸的组成。由于当时对核苷酸和硷基的定量分析不够精确，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的结果，因而曾长期认为DNA结构只是“四核苷酸”单位的重复，不具有多样性，不能携带更多的信息，当时对携带遗传信息的侯选分子更多的是考虑蛋白质。40年代以后实验的事实使人们对核酸的功能和结构两方面的认识都有了长足的进步。1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA；1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了是遗传物质。2、现代分子生物学的建立和发展阶段这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。DNA双螺旋发现的最深刻意义在于：确立了核酸作为信息分子的结构基础;提出了硷基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。在此期间的主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立在发现DNA双螺旋结构同时，Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明；1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型；1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物；70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对真核DNA聚合酶特性做了分析研究；这些都逐渐完善了对DNA复制机理的认识。在研究DNA复制将遗传信息传给子代的同时，提出了RNA在遗传信息传到蛋白质过程中起着中介作用的假说。1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补；逐步阐明了RNA转录合成的机理。在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。50年代初Zamecnik等在形态学和分离的亚细胞组分实验中已发现微粒体（microsome）是细胞内蛋白质合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设；1961年Brenner及Gross等观察了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体的结合；1965年Holley首次测出了酵母丙氨酸tRNA的一级结构；特别是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码，随后研究表明这套遗传密码在生物界具有通用性，从而认识了蛋白质翻译合成的基本过程。上述重要发现共同建立了以中心法则为基础的分子遗传学基本理论体系。1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶，又进一步补充和完善了遗传信息传递的中心法则。以上简要介绍了分子生物学的发展过程，可以看到在近半个世纪中它是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域，推动着整个生命科学的发展。至今分子生物学仍在迅速发展中，新成果、新技术不断涌现，这也从另一方面说明分子生物学发展还处在初级阶段。分子生物学已建立的基本规律给人们认识生命的本质指出了光明的前景，但分子生物学的历史还短，积累的资料还不够，例如：在地球上千姿万态的生物携带庞大的生命信息，迄今人类所了解的只是极少的一部分，还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律；又如即使到2005年我们已经获得人类基因组DNA3x109bp的全序列，确定了人的5-10万个基因的一级结构，但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调，要理解80%以上不为蛋白质编码的序列的作用等等，都还要经历漫长的研究道路。可以说分子生物学的发展前景光辉灿烂，道路还会艰难曲折。三、分子生物学的主要研究内容分子生物学主要包含以下三部分研究内容：1.核酸的分子生物学核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。2.蛋白质的分子生物学蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。3.细胞信号转导的分子生物学细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。

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现在的热门是protein-protein interaction。简单地说就是人工制作activator或者repressor，去掉这些regulatory protein的某些部分，看看某些基因能否表达。 这些可应用于分子探针检测疾病、物质什么的。我现在在和我老板做这个研究，之前他发的paper的IF都有24+。另外还有荧光探针的实验，也是热门~其他的基本实验正如 阎依秋 所说，我就不重复了。

现代分子生物学主要是从分子水平上阐述生命现象和本质的科学,是现代生命科学的“共同语言”.分子生物学又是生命科学中进展迅速的前沿学科,它的理论和技术已经渗透到其他基础生物学科的各个领域,它的主要核心内容是通过生物的物质基础---核酸、蛋白、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用的运动规律的研究来阐明生命分子基础,从而探讨生命的奥秘.这门课与基因工程关系很大,主要讲了核酸、蛋白、酶等生物大分子的结构、功能以及它们之间的相互作用.

PCR分子克隆核酸电泳、琼脂糖凝胶电泳测序DNA， RNA 提取转化外源DNA体外转录、逆转录cDNA文库构建原位杂交、酵母双杂交、差减杂交、扣除杂交蓝白斑筛选、抗生素筛选 基因工程技术大部分都是依据分子生物学原理设计出来的。

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IP：Immunoprecipitation免疫沉淀反应 CO-IP为免疫共沉淀

包含了生物大分子制备和分析常用技术、蛋白质与核酸的提取与分离、PCR技术、分子杂交与印迹技术、分子克隆技术、外源基因转移技术、蛋白质表达技术、分子标记技术、分子改造技术、测序及人工合成技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、生物芯片技术、生物信息学技术、RNA研究技术等.