96孔板培养的，实验方法是将细菌放入孔中培养

用洗面奶洗脸后，用浓盐水涂抹在毛孔粗大的地方，然后轻轻按摩5-6分钟后用清水洗净，每天至少两次，一周左右见效MM秘方哦

不同的细胞体积大小会不一样，一般的会按1*10^5/ML加 每孔10000个左右

350vl。每孔容量为350vl，样品加样100vl。如果是做Elisa的话样品是加10uL，总容量是350uL左右，少加一点，因为满了容易溢出来，根据你要加的体系改变。

一般平底的96孔板，最多可装到350ul，但是与口平齐。放300ul还是可以的。用圆底或平底主要看你实验要求。

1到2万每个孔。对于96孔板，RAW细胞的推荐种植密度为1到2万每个孔。这个密度是根据细胞的生长特性和96孔板的大小和形状等因素综合考虑得出的。

这就多了

胰酶消化，打散，培养基稀释后用移液枪分装到96孔板

作为一只生物在读…… 我只想说，因为要一般平行试验要设3组啊…… 所以要有一个3的倍数会比较好排孔 所以细胞版都是6,12,24,48,96,384 这些对我来说都是整数呢→_→ 买10块钱儿的饼要加个2块酸奶凑个整才开心好么→_→

52个孔左右。96孔板里一般种3000到5000个细胞每孔，按照96是12的倍数利于数理统计，每圈有52个孔左右。

酶联免疫吸附试验就是ELISA，每个反应板上有96个反应孔。

会导致细胞分布不均匀。遇到这种情况可以手动解决。1、植板后，用手拿起96孔板，左右摇动，然后来回摇动几次，可以使细胞分布均匀。2、在96孔板的每个孔上，加入100微升的细胞悬浮液。把它从左边加到洞底。加入一半板材后，与未加入的细胞悬浮液混合，然后继续加入剩余的一半板材。3、盖上盖子后，用左手轻轻握住木板的左边，然后用右手轻拍木板的右边缘，剩下的三面逐一拍打，静置5分钟左右，然后放入37度的培养箱即可。

细胞铺板重在均匀。细胞铺板时，要每孔分布的细胞数量一致，就是从瓶中吸取细胞悬液的时候，每次吸取都要混匀后吸取，尽量做到平均分配。其次，铺板后用手拍打板壁，动作轻柔些。

一种长链烷烃季铵化抗菌剂的制备方法及其产品和应用与流程文档序号：17186802发布日期：2019-03-22 21:26阅读：387来源：国知局导航： X技术> 最新专利>有机化合物处理,合成应用技术本发明属于生物医用材料领域，涉及一种长链烷烃季铵化抗菌剂的制备方法及其产品和应用。背景技术：目前随着人们安全健康意识的增强，对高效抗菌剂的需求更加迫切。在目前的抗菌产业化应用当中，主要通过投入小分子抗菌剂如季铵盐类抗菌剂、氧化锌类和氧化银类等。但是小分子抗菌剂存在不易加工、化学稳定性差和较高的毒性等诸多缺点。聚合物抗菌剂可以很好的客服上述缺点，较小分子抗菌剂，聚合物抗菌剂具有良好的稳定性和非溶出性，具有较高的生物安全性。季铵化聚合物普遍接受的抗菌机理为“穿透型抗菌机理”，其中包括4个步骤：1)季铵化聚合物具有较强的正电性，能够通过强烈的静电相互作用将菌体吸附到季铵化聚合物；2)在亲脂性烷基取代链的作用下，穿透细胞壁；3)破坏细胞质膜，影响细菌呼吸过程中的电子传递和氧化磷酸化过程；4)微生物死亡。与细菌相比，哺乳动物细胞膜受季铵化的影响较小，生物相容性也更高。但是，目前广泛使用的聚合物季铵盐抗菌都是小分子季铵盐聚合制备得到，工艺流程复杂，成本昂贵，且抗菌效果不佳。此外，黄曲霉菌(atcc9643)、单核细胞增生李斯特氏菌(atcc19115)、幽门螺杆菌(atcc43504)和铜绿假单胞菌(atcc27853)也是食品贮藏、医疗卫生用品等评估的菌种。在自然环境中，黄曲霉菌(atcc9643)是一种常见的霉菌，多分布再植物及果实上，在储存的肉类中也会含有。它也是一种人类的病原，会造成肺的曲菌症(aspergillosis)，有时候也会引起角膜、耳与鼻眼框的感染。许多菌种会产生足量的黄曲霉毒素，这是一种有致癌性且有剧烈毒性的化合物。单核细胞增生李斯特氏菌(atcc19115)为革兰氏阳性菌，是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，是食品卫生检验中的特殊菌种。幽门螺杆菌(atcc43504)是一种革兰氏阴性杆菌，传染力很强，可通过手、不洁食物、不洁餐具、粪便等途径传染，在自来水中存活4-10天，在河水中存活长达3年。是传染性胃炎、慢性咽炎、口腔溃疡等消化性溃疡的主要原因。铜绿假单胞菌(atcc27853)，属于革兰阴性杆菌，该菌广泛存在于自然界的土壤和水中，亦可寄生于正常人皮肤和结膜囊，容易引起急性化脓性角膜炎，使大部分角膜将坏死，脱落，导致穿孔，进一步引起眼内炎，甚至全眼球炎。目前针对上述菌种的有效抗菌方法多为抗生素，而基于季铵化抗菌剂的有效抗菌制备方法还未有公开。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种长链烷烃季铵盐抗菌剂的制备方法及其产品和应用。本发明具体提供了如下的技术方案：1、一种长链烷烃季铵化抗菌剂的制备方法，在富含叔胺的聚合物上通过化学修饰引入长链卤代烷，所述长链卤代烷的烷基上的碳原子数不少于7。进一步，所述富含叔胺的聚合物为聚乙烯亚胺、聚2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯、聚2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯聚合物、聚2-(二乙氨基)甲基丙烯酸乙酯、聚2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯、聚2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯、聚2-(二异丙基氨基)丙烯酸乙酯、聚n-(3-(二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺或聚n-(3-(二甲氨基)丙基丙烯酰胺。进一步，所述长链卤代烷的烷基上的碳原子数为7～50。进一步，所述富含叔胺的聚合物的分子量为1000-100000道尔顿。进一步，所述长链卤代烷包括碘代烷、溴代烷或氯代烷。进一步，所述长链卤代烷的烷基为庚烷基、辛烷基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、三十烷基或四十烷基。进一步，所述化学修饰的步骤为将富含叔胺的聚合物和长链卤代烷置于溶剂中，在20℃～30℃下搅拌24～72小时。进一步，所述富含叔胺的聚合物和长链卤代烷的摩尔比为100：1～1：10000。进一步，所述溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇、二氧六环、乙酸乙酯、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。2、按照上述方法制备得到的长链烷烃季铵化抗菌剂。3、按上述制备得到的长链烷烃季铵化抗菌剂的应用，用于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌抑菌。本发明的有益效果在于：本发明的富叔氨基的聚合物通过与环境中水的结合电离作用以及季胺化作用因而具有较强的正电性，而细菌的细胞壁和细胞膜内含有很多蛋白质，这些蛋白质的等电点较低，外界中性环境时具有较强的负电性，因此，富氨基的聚合物能够通过强烈的静电相互作用将菌体吸附聚集到聚合物的表面，增强对细菌的杀伤作用。而含氨基的小分子季铵盐由于其分子量小，所以与菌体的静电相互作用较弱。本发明通过长链卤代烷烃(碳原子数不小于7)的季铵化反应过程制备成季铵化聚合物，所得到的季铵化聚合物的长链烷烃部分能有效破坏细菌细胞膜，具有更好的杀菌效果。在季胺化聚合物破坏细菌膜的过程中，季胺化聚合物的极性头和细菌细胞膜的磷脂双分子层极性头相互作用，季胺化聚合物的烷烃部分被平行固定于磷脂双分子层内。由于双层的横向扩散运动，以及烷烃链端季胺化聚合物的自由体积效应，使得细菌细胞膜磷脂双分子层疏水区的包装密度受到影响。在这个过程中，季胺化聚合物在水相和磷脂双分子层的分配系数随着烷烃链长的增加呈指数幂增加。短链卤代烃所构建的季胺化聚合物由于烷烃链短，和细菌膜磷脂双分子层的相互作用弱，而烷烃链端季胺化聚合物的自由体积效应较大，使得水相和双层的分配系数较小，无法对细菌细胞膜进行有效的破坏，产生杀菌作用。而长链烷烃可以和磷脂双分子层疏水区进行很好的匹配，使得季胺化聚合物的分配系数增加，更好的破坏细菌的磷脂双分子层结构，导致细胞膜的破裂和细胞内容物的渗漏，最终导致细菌的死亡。本发明制得的抗菌剂，相比于短链烷烃季铵化抗菌剂，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念球菌等常见菌种具有优异的抗菌效果，可满足医疗、工业、日常抗菌消毒应用。该抗菌剂针对作为人体致病菌的幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌具有优良的抗菌效果，可用于特种医疗、水处理等卫生健康领域。该抗菌剂对黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌具有优异的抗菌效果，可以用于生鲜食物及冷藏食物的抗菌保鲜，医疗卫生等领域。本发明的方法安全简单，室温下即可进行，并且不采用毒性较大的四氢呋喃溶剂，具有简单易控制的生产工艺，可操作性强，也可降低在制备过程中对操作人员的潜在身体危害，可应用于工业化生产，开发应用极具有发展前景。本发明的抗菌剂的mic浓度远低于其安全细胞毒性浓度，说明在具备抗菌效果的浓度剂量下不会产生细胞毒性，具备生物安全性。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：图1为季铵盐抗菌剂、碘甲烷季铵化聚乙烯亚胺和聚季胺盐-32的细胞毒性。具体实施方式下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1在50ml乙腈溶液中加入10g分子量为1800道尔顿的聚乙烯亚胺和0.11g溴代辛烷(聚乙烯亚胺和溴代辛烷的摩尔比为10：1)，室温搅拌24小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂1。实施例2在50ml甲醇溶液中加入5g分子量为20000道尔顿的聚2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和0.03g氯代十三烷(聚2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和氯代十三烷的摩尔比为1：1)，室温搅拌72小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂2。实施例3在20ml四氢呋喃溶液中加入5g分子量为1000道尔顿的聚2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯和0.02g碘代十六烷(聚2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯和碘代十六烷的摩尔比为100：1)，室温搅拌36小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂3。实施例4在5mln,n-二甲基甲酰胺溶液中加入1g分子量为1000000道尔顿的聚2-(二乙氨基)甲基丙烯酸乙酯和1.51g溴代十五烷(聚2-(二乙氨基)甲基丙烯酸乙酯和溴代十五烷的摩尔比为1：10000)，室温搅拌40小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂4。实施例5在5ml乙酸乙酯溶液中加入2g分子量为30000道尔顿的聚2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯和7.6g碘代十八烷(聚2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯和碘代十八烷的摩尔比为1：300)，室温搅拌60小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂5。实施例6在20ml正己烷溶液中加入1g分子量为2000道尔顿的聚2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯和1.26g溴代三十烷(聚2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯和溴代三十烷的摩尔比为1：5)，室温搅拌60小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂6。实施例7在20ml异丙醇溶液中加入1g分子量为500000道尔顿的聚2-(二异丙基氨基)丙烯酸乙酯和0.93g氯代壬烷(聚2-(二异丙基氨基)丙烯酸乙酯和氯代壬烷的摩尔比为1：5000)，室温搅拌72小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂7。实施例8在10ml二甲基亚砜溶液中加入1g分子量为20000道尔顿的聚n-(3-(二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺和6.58g溴代十三烷(聚n-(3-(二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺和溴代十三烷的摩尔比为1：500)，室温搅拌70小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂8。实施例9在20ml四氢呋喃溶液中加入1g分子量为150000道尔顿的聚n-(3-(二甲氨基)丙基丙烯酰胺和12g碘庚烷(聚n-(3-(二甲氨基)丙基丙烯酰胺和碘庚烷的摩尔比为1：8000)，室温搅拌50小时后，常规纯化干燥，得到季铵化抗菌剂9。实施例10为了证明本发明的有益效果，对实施例1-8中的季铵化抗菌剂与市售聚季铵盐-32进行了对比测试，具体试验情况如下：1.抗菌性能试验抗菌剂的抗菌性能由最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)来进行表征，mic是测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标，指在体外培养细菌24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度。(1)抗菌剂贮存液制备将季铵化抗菌剂稀释到无菌水中，制成2560μg/ml的原液。(2)培养基制备使用普通营养肉汤培养基、沙堡氏琼脂培养基、lb肉汤培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基，察氏培养基、幽门螺杆菌琼脂培养基(3)mic板制作将倍比稀释后不同浓度的季铵化抗菌剂贮存液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加季铵化抗菌剂贮存液，每孔10μl，抗菌剂浓度分别为2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/ml，第12孔不加抗菌剂作为阳性对照。(4)接种物制备将浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经lb肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加90μl。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml，密封后置37℃摇床孵育24h后判断结果。(5)结果判断在阳性对照孔内细菌明显生长的前提下，通过酶标仪测定od600，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度为mic。2.细胞毒性实验根据mtt比色法评价对小鼠成纤维细胞(l929)的细胞毒性。用含10％胎小牛血清的培养液配成细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl，并在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育12小时，用培养液将季铵化抗菌剂进行浓度梯度稀释，使加入96孔板的最终浓度梯度为2048、1024、512、256、128、64、32μg/ml，每个浓度重复3次。培养24小时后，用pbs缓冲液洗涤细胞，然后向每孔加入20μl等份的mtt，继续培养4小时。最后每孔加入150μl二甲基亚砜，用酶标仪测定各孔od490，以细胞存活率≥80％为安全细胞毒性。表1抗菌剂的抗菌性能及安全细胞毒性对比表2抗菌剂对黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌性能对比表1对比了实施例1～9得到的抗菌剂与短链卤代烷碘甲烷季铵化的聚乙烯亚胺对于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的mic。mic是令细菌停止发育和分裂的最低抗菌剂浓度，此浓度越低，说明抗菌能力越强。可以看出：实施例1～9的得到的抗菌剂对于不同菌落的mic均远低于其安全细胞毒性，因此本发明的抗菌剂在其安全细胞毒性的范围内可以产生良好的抗菌效果。而碘甲烷季铵化的聚乙烯亚胺抗菌剂和市售聚季胺盐-32的安全细胞毒性剂量分别为512μg/ml和32μg/m，其能够产生的抗菌mic远高于其安全细胞毒性剂量，说明在其产生抗菌效果的同时也会对正常细胞产生毒性杀伤作用。因此，本发明的用长链卤代烷(至少7个碳原子)季铵化聚合物相比于碘甲烷(碳原子仅为1)季铵化的聚乙烯亚胺抗菌剂和市售聚季胺盐-32具有更好的抗菌效果。这是由于季铵化聚合物的长链烷烃部分能有效作用于细菌细胞膜，增强与细菌亲脂性磷脂双分子层的相容性，细菌细胞膜遭受的破坏更大，胞内物质的释放更明显，从而更好的破坏细胞并杀死细菌。目前针对黄曲霉菌(atcc9643)、单核细胞增生李斯特氏菌(atcc19115)、幽门螺杆菌(atcc43504)和铜绿假单胞菌(atcc27853)菌种的有效抗菌方法仅有抗生素，而没有季铵化抗菌剂能对它们产生广谱抗菌效果。表2表明，本发明的抗菌剂对黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌和铜绿假单胞菌均具有非常优异的抗菌效果。而碘甲烷季铵化聚乙烯亚胺的对这四种细菌的mic值远高于本发明的抗菌剂。因此说明，用长链卤代烷季铵盐化的抗菌剂抗菌效果远远好于短链卤代烷(例如碘甲烷)季铵盐化的聚乙烯亚胺抗菌剂，说明本发明抗菌剂具有优异的广谱抗菌效果。图1对比了几种抗菌剂的细胞毒性，从图1中可以看出：(1)抗菌剂1、2、9在512μg/ml时细胞存活率为100％，抗菌剂3、4、5、6、7、8在512μg/ml时细胞存活率大于80％，因此抗菌剂1-9在512μg/ml时均不具备细胞毒性。结合表1和表2，抗菌剂1-9对于不同菌落的mic均低于512μg/ml，说明抗菌剂1-9的使用剂量在512μg/ml以下时可完全产生抗菌作用，而不会产生细胞毒性。(2)碘甲烷季铵化的聚乙烯亚胺在512μg/ml时细胞存活率大于80％，为其安全细胞毒性，而其对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌的抗菌mic分别为2048、1024、2048、2048、2048、2048、1024μg/ml，其mic均大于其安全细胞毒性浓度，说明碘甲烷季铵化的聚乙烯亚胺在具备抗菌效果的浓度剂量下会产生细胞毒性，不具备生物安全性。(3)聚季胺盐-32在32μg/ml时细胞存活率大于80％，在512μg/ml时细胞存活率仅40％，和抗菌剂1-9相比具有明显的细胞毒性。同时聚季胺盐-32对大肠埃希菌、白色念球菌、黄曲霉菌、单核细胞增生李斯特氏菌、幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌的抗菌mic分别为64、256、64、256、256、64μg/ml，其mic均大于其安全细胞毒性浓度，在用于这些菌落的抗菌时会产生细胞毒性，不具备生物安全性。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

pcr96孔板排列：从左到右：1阴极K、2控制G、3阳极A。如果要求不是特别苛刻的话，可以用分光光度计测定OD值。因为DNA的浓度与260nm处的吸光度成正比，所以只要测定了初始溶液的OD值，按比例加入即可。普通PCR主要根据样品数来决定，如果同时做大量样本，选择96，而定量pcr选择96，因为定量通常样品很多，好的定量pcr两者无差别，有些带梯度的PCR要使用该功能对block有要求。根据使用者的操作方式可分为水平式和垂直式两种（概述图为水平式）。另外根据离心力大小，又分别具有甩板和离心的2种不同效果之分，一般垂直式仅有甩板的效果，而水平式则兼有甩板和离心效果。对于适用的96孔板种类及数量，以适用性及通量较大的水平式为例，一次可处理2块PCR板、4-6块酶标板、2块深孔板、以及各种微孔板等其他96孔板。

稀释倍数等于原液浓度除以（原液浓度乘以移取体积除以定容体积）。稀释倍数等于原液浓度除以（原液浓度乘以移取体积除以定容体积），稀释指对现有溶液加入更多溶剂而使其浓度减小的过程。在稀释后溶液的浓度减小，但溶质的总量不变。

只能在加tips的时候加上你要的数量。其实排枪很不精确，96孔板有边孔效应，最好不用边孔

6孔板相对还是挺容易把细胞铺匀的，弄不好的话细胞主要在边上。 所以，你加2ml混匀的细胞悬液，加在中间位置，让他自动往两边扩散，当然新板子有时候它扩散不了。你就稍微动一下就行。铺完板子后，要趁细胞没有沉底的时候

每孔是加100微升细胞悬液。一般96孔板，每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。

6孔板底面积是9.6平方厘米，96孔板底面积是0.32平方厘米，所以6孔板比96孔板面积大。

每个孔都是一样的，没有代表什么

面稳定性好,细胞贴附力强等特点,缺点培养的细胞未涂有抗体。

亲水性、成型区别。1、亲水性：96孔uv板的表面被处理为相对亲水的对于实验细胞粘附是有利的，普通96孔板只是普通铁板没有进行处理。2、成型区别：96孔uv板底部是与丙烯酸板体一次成型，而普通96孔则是工厂加工而成型。

96孔板的每孔准确体积是365ul。96孔细胞培养板、皿系列产品选用进口光学透明纯聚苯乙稀制造。采用特殊工艺而成，使细胞达到最佳吸附状态，所有产品均以伽玛射线灭菌处理。

不知所云，想真正得到帮助要把问题说清楚！

96孔板有3人份的。96孔板每一孔250μl。通常每一孔不少于100μl，每毫升不少于104个细胞！所以每一孔≥26个细胞，具体放多少根据自己需求，有的是每一孔放一个细胞。

根据细胞生长的速度来决定，96孔板的每孔体积100~200ul，种细胞数一般都是2000~10000个/孔，最好不要超过10000个/孔。同理，24孔板每孔大约500ul，那么细胞数一万为佳。

6孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,

6孔板底面积9.6cm；培养液2.5ml；12孔板底面积4.5cm；培养液2ml；24孔板底面积2cm；培养液1ml；96孔板底面积0.32cm；培养液0.1ml。孔板流量计又称为差压式流量计，是由一次检测件(节流件)和二次装置(差压变送器和流量显示仪)组成，广泛应用于气体、蒸汽和液体的流量测量。具有结构简单，维修方便，性能稳定，使用可靠等特点。扩展资料：孔板是测量流量的差压发生装置，配合各种差压计或差压变送器可测量管道中各种流体的流量。节流装置包括环室孔板，喷嘴等。节流装置与差压变送器配套使用，可测量液体、蒸汽、气体的流量，它广泛应用于石油、化工、冶金、电力、轻工等部门。充满管道的流体，当它们流经管道内的节流装置时，流束将在节流装置的节流件处形成局部收缩，从而使流速增加，静压力低，于是在节流件前后便产生了压力降，即压差，介质流动的流量越大，在节流件前后产生的压差就越大，所以可以通过测量压差来衡量流体流量的大小。这种测量方法是以能量守衡定律和流动连续性定律为基准的。参考资料来源：百度百科-孔板

6孔板底面积9.6cm2，加培养液的量2.5ml。12孔板底面积4.5cm2，加培养液的量2ml。24孔板底面积2cm2，加培养液的量1ml。96孔板底面积0.32cm2，加培养液的量0.1ml。无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。为保证细胞能在体外环境中生长繁殖，必须要确保无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。扩展资料：注意事项（1）第一次开始培养某种细胞时，一定要对该细胞的名称进行检索，可以得到关于该细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂、通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。（2）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：1、确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。2、确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。3、确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。4、确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。5、尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。6、操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。7、实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。参考资料来源：百度百科-细胞培养

96孔板一般就是看细胞生长情况啊，你养之前数一下，后面再数一下，就得出情况了嘛。为什么要纠结非得放多少细胞呢？

6孔板底面积9.6cm；培养液2.5ml；12孔板底面积4.5cm；培养液2ml；24孔板底面积2cm；培养液1ml；96孔板底面积0.32cm；培养液0.1ml。孔板流量计又称为差压式流量计，是由一次检测件(节流件)和二次装置(差压变送器和流量显示仪)组成，广泛应用于气体、蒸汽和液体的流量测量。具有结构简单，维修方便，性能稳定，使用可靠等特点。扩展资料：孔板是测量流量的差压发生装置，配合各种差压计或差压变送器可测量管道中各种流体的流量。节流装置包括环室孔板，喷嘴等。节流装置与差压变送器配套使用，可测量液体、蒸汽、气体的流量，它广泛应用于石油、化工、冶金、电力、轻工等部门。充满管道的流体，当它们流经管道内的节流装置时，流束将在节流装置的节流件处形成局部收缩，从而使流速增加，静压力低，于是在节流件前后便产生了压力降，即压差，介质流动的流量越大，在节流件前后产生的压差就越大，所以可以通过测量压差来衡量流体流量的大小。这种测量方法是以能量守衡定律和流动连续性定律为基准的。参考资料来源：百度百科-孔板

6孔板底面积9.6cm；培养液2.5ml；12孔板底面积4.5cm；培养液2ml；24孔板底面积2cm；培养液1ml；96孔板底面积0.32cm；培养液0.1ml。孔板流量计又称为差压式流量计，是由一次检测件(节流件)和二次装置(差压变送器和流量显示仪)组成，广泛应用于气体、蒸汽和液体的流量测量。具有结构简单，维修方便，性能稳定，使用可靠等特点。扩展资料：孔板是测量流量的差压发生装置，配合各种差压计或差压变送器可测量管道中各种流体的流量。节流装置包括环室孔板，喷嘴等。节流装置与差压变送器配套使用，可测量液体、蒸汽、气体的流量，它广泛应用于石油、化工、冶金、电力、轻工等部门。充满管道的流体，当它们流经管道内的节流装置时，流束将在节流装置的节流件处形成局部收缩，从而使流速增加，静压力低，于是在节流件前后便产生了压力降，即压差，介质流动的流量越大，在节流件前后产生的压差就越大，所以可以通过测量压差来衡量流体流量的大小。这种测量方法是以能量守衡定律和流动连续性定律为基准的。参考资料来源：百度百科-孔板

深孔板96孔,尺寸为2ml,圆型存储条件。

6孔板底面积9.6cm；培养液2.5ml；12孔板底面积4.5cm；培养液2ml；24孔板底面积2cm；培养液1ml；96孔板底面积0.32cm；培养液0.1ml。孔板流量计又称为差压式流量计，是由一次检测件(节流件)和二次装置(差压变送器和流量显示仪)组成，广泛应用于气体、蒸汽和液体的流量测量。具有结构简单，维修方便，性能稳定，使用可靠等特点。扩展资料：孔板是测量流量的差压发生装置，配合各种差压计或差压变送器可测量管道中各种流体的流量。节流装置包括环室孔板，喷嘴等。节流装置与差压变送器配套使用，可测量液体、蒸汽、气体的流量，它广泛应用于石油、化工、冶金、电力、轻工等部门。充满管道的流体，当它们流经管道内的节流装置时，流束将在节流装置的节流件处形成局部收缩，从而使流速增加，静压力低，于是在节流件前后便产生了压力降，即压差，介质流动的流量越大，在节流件前后产生的压差就越大，所以可以通过测量压差来衡量流体流量的大小。这种测量方法是以能量守衡定律和流动连续性定律为基准的。参考资料来源：百度百科-孔板

6孔板底面积9.6cm；培养液2.5ml；12孔板底面积4.5cm；培养液2ml；24孔板底面积2cm；培养液1ml；96孔板底面积0.32cm；培养液0.1ml。孔板流量计又称为差压式流量计，是由一次检测件(节流件)和二次装置(差压变送器和流量显示仪)组成，广泛应用于气体、蒸汽和液体的流量测量。具有结构简单，维修方便，性能稳定，使用可靠等特点。扩展资料：孔板是测量流量的差压发生装置，配合各种差压计或差压变送器可测量管道中各种流体的流量。节流装置包括环室孔板，喷嘴等。节流装置与差压变送器配套使用，可测量液体、蒸汽、气体的流量，它广泛应用于石油、化工、冶金、电力、轻工等部门。充满管道的流体，当它们流经管道内的节流装置时，流束将在节流装置的节流件处形成局部收缩，从而使流速增加，静压力低，于是在节流件前后便产生了压力降，即压差，介质流动的流量越大，在节流件前后产生的压差就越大，所以可以通过测量压差来衡量流体流量的大小。这种测量方法是以能量守衡定律和流动连续性定律为基准的。参考资料来源：百度百科-孔板

96是12的倍数 利于数理统计 12个为一打 还有24孔 48孔

1、一般96孔板,每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。6孔板12孔板或24孔板，均采用将第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好，所以我放弃改用浸润孔底的方法。2、细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。3、如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。4、细胞要尽量打散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮！还有转移到六孔板后，是要晃得！晃的时候最好不要让那个细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀！5、一瓶细胞长满后，正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈 右三圈 前三圈 后三圈。基本上24小时之后观察 每孔的细胞都会很均匀。6、计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。7、放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向5到6次，但关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。

这个也行你可以计算一下的

如何保证铺板时的细胞浓度一致1、一般96孔板,每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。 6孔板12孔板或24孔板，均采用将第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好，所以我放弃改用浸润孔底的方法。 2、细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。 3、如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。 4、细胞要尽量打散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮！还有转移到六孔板后，是要晃得！晃的时候最好不要让那个细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀！ 5、一瓶细胞长满后，正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈 右三圈 前三圈 后三圈。基本上24小时之后观察 每孔的细胞都会很均匀。 6、计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。 7、放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向5到6次，但关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。

1、一般96孔板,每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。6孔板12孔板或24孔板，均采用将第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好，所以我放弃改用浸润孔底的方法。2、细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。3、如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。4、细胞要尽量打散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮！还有转移到六孔板后，是要晃得！晃的时候最好不要让那个细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀！5、一瓶细胞长满后，正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈 右三圈 前三圈 后三圈。基本上24小时之后观察 每孔的细胞都会很均匀。6、计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。7、放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向5到6次，但关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。

后面还掉了一个字酶联免疫吸附试验96孔板，是一个12×8的板子，上面可以同时进行96次免疫吸附反应

【酶标仪用96孔板】 我只用过这个 ，就是点样然后放到酶标仪里检测，其它两个不清楚，血凝板可能是加了抗凝剂的什么吧~·不清楚，你还是查阅一些资料的好，实验越精贵就越难做，别因为这个把实验搞砸了，祝你好运！！

3天。每孔要加100ul培养基,细胞接种的密度,密度适中的话培养3天。复苏杂交瘤细胞后，细胞长得一直快，开始复苏后就不长，后转入96孔板3天后才有的克隆，又一周转入24孔板，又一周才转入培养瓶，转入瓶的细胞也长得慢，一周传不了一次代。

乙酰化离心没有上清液：一种通过乙酰化得到的新型抗肿瘤化合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60 Superdex-200 prep grade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)Ac-PSG的制备：称取0.3g经冷冻干燥的PSG于反应试管中，加入10mL蒸馏水，混合均匀后加入0.5mol/L的NaOH调节pH值为9.0，30℃保温4h。在此期间边搅拌边分6次向溶液中加入一定量的乙酸酐，同时不断滴加0.5mol/L的NaOH以保持pH值为8.0，反应结束后，用5mol/L的HCl调整溶液的pH值为7.0，将混合液置于透析袋中对蒸馏水透析3天(透析袋截留相对分子质量为8 000～12 000)，透析袋内液加入4倍体积无水乙醇反复沉淀，挥干乙醇后，研磨，过筛得白色粉末状产物，分别记为Ac-PSG。本发明乙酰化产物Ac-PSG，能够刺激巨噬细胞，明显增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清中TNF-α的蛋白表达量，使机体的免疫功能加强，进而增强抵抗疾病的能力，还原力强，能够中和更多的亚油酸自由基和其他在体系中形成的自由基，减缓β-胡萝卜素的褪色，可用于抗肿瘤。附图说明图1为Ac-PSG1的高效凝胶渗透色谱图。图2为PSG、Ac-PSG3的红外光谱图。图3为PSG、Ac-PSG1，Ac-PSG 2清除DPPH自由基的能力示意图。图4为PSG、Ac-PSG1，Ac-PSG 2抑制β–胡萝卜素-亚油酸体系氧化的能力示意图。具体实施方式实施例1：一种通过乙酰化得到的新型抗肿瘤化合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60 Superdex-200 prep grade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)Ac-PSG的制备：称取0.3g经冷冻干燥的PSG于反应试管中，加入10mL蒸馏水，混合均匀后加入0.5mol/L的NaOH调节pH值为9.0，30℃保温4h。在此期间边搅拌边分6次向溶液中加入1mL的乙酸酐，同时不断滴加0.5mol/L的NaOH以保持pH值为8.0，反应结束后，用5mol/L的HCl调整溶液的pH值为7.0，将混合液置于透析袋中对蒸馏水透析3天(透析袋截留相对分子质量为8 000～12 000)，透析袋内液加入4倍体积无水乙醇反复沉淀，挥干乙醇后，研磨，过筛得白色粉末状产物，分别记为Ac-PSG1。实施例2：一种通过乙酰化得到的新型抗肿瘤化合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60 Superdex-200 prep grade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)Ac-PSG的制备：称取0.3g经冷冻干燥的PSG于反应试管中，加入10mL蒸馏水，混合均匀后加入0.5mol/L的NaOH调节pH值为9.0，30℃保温4h。在此期间边搅拌边分6次向溶液中加入3mL的乙酸酐，同时不断滴加0.5mol/L的NaOH以保持pH值为8.0，反应结束后，用5mol/L的HCl调整溶液的pH值为7.0，将混合液置于透析袋中对蒸馏水透析3天(透析袋截留相对分子质量为8 000～12 000)，透析袋内液加入4倍体积无水乙醇反复沉淀，挥干乙醇后，研磨，过筛得白色粉末状产物，分别记为Ac-PSG2。实施例3：一种通过乙酰化得到的新型抗肿瘤化合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60 Superdex-200 prep grade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)Ac-PSG的制备：称取0.3g经冷冻干燥的PSG于反应试管中，加入10mL蒸馏水，混合均匀后加入0.5mol/L的NaOH调节pH值为9.0，30℃保温4h。在此期间边搅拌边分6次向溶液中加入5mL的乙酸酐，同时不断滴加0.5mol/L的NaOH以保持pH值为8.0，反应结束后，用5mol/L的HCl调整溶液的pH值为7.0，将混合液置于透析袋中对蒸馏水透析3天(透析袋截留相对分子质量为8 000～12 000)，透析袋内液加入4倍体积无水乙醇反复沉淀，挥干乙醇后，研磨，过筛得白色粉末状产物，分别记为Ac-PSG3。一、产物的理化性质对实施例1-3制得的Ac-PSG进行红外光谱分析和乙酰化程度的测定，同时测定纯度、平均分子量、糖醛酸含量。(1)纯度鉴定用高效渗透凝胶色谱法进行纯度的检测，取测试样品3mg溶于1mL蒸馏水，1000rpm离心10min，用微孔过滤膜过滤后自动上样20μL，记录洗脱曲线用于判定该组分的纯度。实验所用的HPLC的具体测试条件如下：色谱柱为UltrahydrogelTM500 300mm×7.8mmid；流动相为0.1MNaCl；流速0.6mL/min；柱温35℃。(2)分子量测定液相色谱柱为UltrahydrogelTM500 300mm×7.8mmid，流动相为0.1MNaCl，流速为0.6mL/min，柱温为35℃。配制各标准品Glc，T10，T40，T70，T500，T2000 2％溶液，各溶液在HPLC进样后得到相应的液相图谱。设定T2000的洗脱体积为柱的空体积V0，Glc的洗脱体积作为柱的总体积Vt，以公式Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)计算，以LogMw-Kav作图得标准曲线。根据样品的Ve，从标准曲线上即得样品的分子量。由于洗脱液的流速恒定，所以可以绘制出保留时间与分子量关系的标准曲线，根据其回归方程即可求得各产物的分子量。(3)糖醛酸含量测定a、采用改良的硫酸咔唑法，以半乳糖醛酸为标准测定糖醛酸的含量。b、高效液相色谱法色谱条件色谱柱：Sugar-PakⅠ(300mm×6.5mm)，流动相：0.0001mol/L EDTA水溶液，流速：0.6mL/min，示差检测器，柱温：90℃，示差检测池温度：40℃，进样量：20μL。标准曲线的绘制精密称取半乳糖醛酸对照品适量，加超纯水溶解，摇匀，制得0.16432，0.32864，0.49296，0.65728，0.8216，0.98592，1.15024，1.31456，1.47888mg/mL的系列标准溶液。按上述色谱条件分别进样20μL，测定半乳糖醛酸峰面积，以半乳糖醛酸峰面积为横坐标，对照品浓度(mg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线。求得回归方程。样品糖醛酸含量的测定分别称取一定量的样品，加超纯水溶解并定容至10mL，配制得到样品溶液。按标准曲线制作时的色谱条件测定，由回归方程计算样品中糖醛酸的含量。(4)红外光谱(IR)分析取1-2mg样品，用KBr压片进行常规IR分析，红外光谱仪测定参数如下：背景扫描次数：128次；分辨率：4.0cm-1；检测器：DTGS。(5)乙酰化程度的测定将l0mg乙酰化Ac-PSG样品置于一指形试管中，将试管与样品一同置于五氧化二磷干燥器中，于80℃干燥8h。向试管中加入0.5mL 2.0mo1/L HCl一无水甲醇溶液，试管在乙醇-干冰槽中冷却，用氧气喷灯封口，在100℃保温4h进行甲醇解。冷却后，打开试管，把试管连同内容物一并小心放入蒸馏室中，在4000Pa-5330Pa真空度下进行蒸馏，蒸馏室的温度保持在35-45℃，当所有酸性甲醇都已蒸完后，再向试管中加入无水甲醇，再进行蒸馏，收集并合并两次的蒸馏液于一试管中，对其进行比色测定。将盛有蒸馏液的试管置于20--25℃水浴中保温1-2min，加入1mL水，再加入2mL 0.75mo1/L的高氯酸溶液，再加入1mL高氯酸铁溶液。5min后，在520nm波长处测定吸光度值。标准溶液系1-10μmol乙酸甲酯溶于2mL甲醇-水(l:l，v/v)中，空白溶液为所用的HCL-甲醇溶液。Ac-PSG的改性程度用Ac-PSG中乙酰基的含量表示(AC％)，或用取代度(DS)表示:取代度DS＝1.62×Ac％/(43－0.42×Ac％)表1各产物的平均分子量和基团取代度从表1可以看出，随着乙酰化试剂量的增加，乙酰基的取代度也逐步从0.71增加到1.04，而且乙酰化试剂的量同时对Ac-PSG的分子量影响较大，随着乙酰化程度的深入，Ac-PSG的分子量逐渐减少，当达到高乙酰化取代度时，Ac-PSG的平均分子量降为原来的五分之一。可能是部分糖苷键在乙酰化过程中发生断裂。在红外光谱图2中可以清晰的看到乙酰化PSG比PSG在1735cm-1-1750cm-1(υc＝o)和1200cm-1-1230cm-1(υc-o)处多了强吸收峰，这就是醋酸酐与PSG中羟基反应形成的羧酸酯的吸收峰，证明了乙酰基的存在。而最为明显的是乙酰化PSG在1365cm-1-1380cm-1(δSCH3)出现吸收峰，而在PSG中由于不含甲基，因而没有这个峰，改性程度越高，这个峰的面积也越大。在3600-3100cm-1处为-O-H的伸缩振动吸收峰，在以上图谱中均有出现，说明乙酰基并未将所有的羟基取代。二、功能活性研究1.体外免疫活性实验(1)巨噬细胞的分离与纯化取2只小鼠颈椎脱臼处死，先放入碘伏中3～5min，再放入体积分数75％酒精中浸泡5min脱色，腹腔注入10mL PBS缓冲液，用棉球轻揉腹部1～2min后吸取腹腔液于离心管中，以1000r/min离心5min，弃上清液收集巨噬细胞，胎盼兰染色证实细胞存活率在95％以上，用RPMI-1640培养液调整细胞密度至1.5×105个/mL。将巨噬细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置二氧化碳培养箱(5％CO2、37℃)培养3h后，轻轻吸弃培养液，用PBS洗去未贴壁细胞，即得到纯化的腹腔巨噬细胞。(2)试验分组及处理将纯化的巨噬细胞用RPMI-1640培养液调整细胞密度为5×105/mL，并分为空白对照组(PBS)、阳性对照组(LPS)和不同剂量的给药组接种于96孔培养板中，每组设3个重复孔。每孔培养液总体积100μL，给药组添加GP的终浓度分别为0、10、100、200、400μg/mL，阳性对照组RPMI-1640培养液含LPS终浓度为2μg/mL。将各试验组均置于二氧化碳培养箱(5％CO2、37℃)中孵育至所需的时间，根据测定方法的不同进行不同处理，测定各个指标。(3)巨噬细胞吞噬能力的检测参考王晓京的方法进行。调节巨噬细胞的浓度5×105/mL，以每孔100μ1接种于96孔板，置5％CO2，37℃培养箱培养3h后洗去未贴壁细胞。每孔加入100μL含10％小牛血清的RPMI-1640，按所需剂量加入药物进行培养。培养48h后，每孔加入0.1％中性红生理盐水溶液100μ1，继续培养4h，倾去上清液，用PBS洗3遍，每孔加入细胞溶解液(冰醋酸:乙醇＝1:1)100μL，4℃下放置2-3h，待细胞溶解后在酶标仪上测定540nm处吸光度。(4)TNF-α的蛋白表达检测TNF-α的诱生：制备的巨噬细胞，加入100μg/mL的样品，在5％CO2，37℃下孵育48h后，收集巨噬细胞上清，-70℃保存，供测定TNF-α活性时使用。细胞上清TNF-α的Western blot法：以牛血清白蛋白为标准蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，样品分装-70℃保存。根据各样品蛋白浓度计算上样体积，将细胞上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。再通过电泳将凝胶上的样本转印到PDVF膜上。加入一抗Goat anti-TNF-α进行4℃孵育10～14h，然后加入HRP标记的二抗Rabbit anti-goat Ig-G温育，最后采用ECL法进行显色定影,以β-actin作内参。(5)统计学处理所有数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS11.0统计软件对数据进行处理，检验水准ɑ＝0.05。2.体外抗氧化活性实验(1)对DPPH自由基的清除作用由于本发明产物不溶于高浓度的乙醇溶液，所以要测定本发明产物对DPPH自由基的清除作用，还需要对其方法进行一定的改良，改良后的方法如下：DPPH以95％乙醇配成0.2mmol/L溶液。取1mL不同浓度的样品溶液，2mL新鲜配制的DPPH乙醇溶液和2mL 95％乙醇于同一具塞试管中，充分混匀，于暗处反应30min后，取出于525nm处测定吸光度。空白组用2mL 95％乙醇代替DPPH溶液，对照组为2mL DPPH溶液与3mL 95％乙醇混合。每组样品一式三份，取平均值。反应体系吸光度越低，说明清除DPPH自由基能力越强，DPPH自由基清除率计算公式为：清除率＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％其中，Ai为样品组吸光度值，Aj为空白组吸光度值，Ac为对照组吸光度值。(2)抑制β-胡萝卜素-亚油酸体系氧化实验采用胡萝卜素漂白法考察样品对β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系的抑制效果。取5mgβ-胡萝卜素溶解于50mL氯仿中，向其中加入40mg亚油酸以及400mg曲二通X-100，40℃下旋转蒸发浓缩5min以去除氯仿，加入100mL氧饱和的蒸馏水，充分混合而制得乳浊液体系。取4.5mL上述制备好的乳浊液，加入不同浓度的样品溶液或者超纯水0.5mL，混合均匀后，于470nm下测定吸光度值作为零时刻的吸光度。将反应液置于50℃水浴2h后，再次于470nm处测定吸光度。以不加β-胡萝卜素的反应液为空白试剂，BHT作为阳性对照。样品抗氧化率(％)根据β-胡萝卜素的褪色情况按如下公式进行计算：其中，A0、A0′分别为样品和空白组在零时刻的吸光度；At、At′分别为反应2h后的吸光度。3.结果与讨论(1)各受试物对巨噬细胞吞噬能力的影响非特异性免疫应答是机体生来就有的免疫特性，例如机体皮肤表面的自然屏障，对病毒复制的干扰，吞噬细胞对异物的吞噬等生理的、化学的及细胞的防御。巨噬细胞参与非特异性免疫，其吞噬功能是免疫系统维持自身内环境稳定的重要手段，也是机体产生免疫应答的基础，大多数抗原经巨噬细胞处理后，免疫原性大大增加。因此吞噬是非特异性免疫的关键环节。测定小鼠巨噬细胞的吞噬能力，一般是观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，通过计数来计算吞噬百分率。本发明是采用细胞培养液中添加不同终浓度的受试物，测定巨噬细胞吞噬中性红的能力，根据测定OD值的大小来判定各样品对巨噬细胞吞噬能力的影响

大。96孔板吸收强叔在0到4的吸光度值，属于较大的吸光度值，在紫外光区有较强的紫外吸收。6孔板简介96孔细胞培养板、皿系列产品选用进口光学透明纯聚苯乙烯制造。

96孔板能高压灭菌，96孔板由高纯度聚丙烯制造，材料符合USPVI，化学稳定性高，可以高温灭菌，适合多道移液器以及自动化设备。96孔板其本身材质在当今主要以聚丙烯（PP）为主，能更好适应PCR反应过程中反复高低温设定，并且能够实现高温高压灭菌操作。既可以121℃高压灭菌，也能够长期稳定保存于-80℃。96孔板适用于压敏膜、自黏膜、热封膜、管口边缘凸起、可增加黏合强度、提高密封性。96孔板的使用须知与正常细胞培养一样，使用96孔板。请注意细胞、培养基和器具。在操作过程中要特别注意气流的方向。不要用手移动细菌或物体。使用液体定量给料装置添加液体时，不能混合液体添加头。清洁板需要清洁干净。如果条件允许，请使用洗板机清洗板，以避免交叉污染。严格按照套件说明进行操作，并且反应时间必须准确。测量期间请勿触摸微量滴定板。在传输过程中，请注意不要让微量滴定板握住手。请勿将样品或试剂洒在设备上或内部。另外，手术后要洗手。如果所使用的样品或试剂据说被污染，有毒或生物危险，则应严格按照试剂盒的操作程序进行操作，以防止操作员受到损害。设备与污染物或传染性物质接触后，必须进行清洁和消毒。

不同ELISA试剂盒的酶标板的底，是不同的，里面有经过处理的。细胞培养板的底，是空的，将液体转入，来上酶标仪检测的，只是个容器。

可以。96孔板周孔与中心孔的表面或热力学特征不同，可采用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至孵育温度。

也要看你细胞的大小 一般一孔长满的大概是1万-10万

结肠癌细胞很少有转染试剂能转得了，lipo2000 和30000都试了不行 就用病毒感染，前段时间看到西南大学的一篇文章写的是Advanced DNA/RNA Transfection Reagent转了已经见刊，我们后面用了转染效率很高 ，用AURKA质粒转，细胞密度50%、96孔板每孔使用0.5μg质粒