提取RNA的血清如何冻存

、组织样品采集

1. 首先准备好用于包装样品的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样品编号。

2. 准确切除所需组织。

3. 离体新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。

4. 在RNase-free 的0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。

5. 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。

6. 把样品袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织，样品较多时应分装至多个小袋，不要在一只样品袋中放过多的样品以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘2 张标签纸（标签上注明：客户名、样品名称、编号、日期，粘2 张标签纸是为了防止标签脱落造成样品混乱），迅速转入液氮罐。

7. 填写样品登记单，写明样品名称、组织类型、编号、取样日期、样品处理过程等情况。

注意事项

1. 对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。

2. 不要用 Eppendorf 管保存组织样品，因为 Eppendorf 管从液氮中取出时极易发生爆裂而造成样品损失。

3. 步骤 2～5应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品RNA降解 。

4. 在临床手术过程中采集的病理或正常样品，如果没有条件立即从手术室中取出进行后续处理，请在切除后立即转移到液氮中保存。

二、细胞及血液样品采集

贴壁细胞

1. 贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液；

2. 按每10 cm2 培养面积加1 mL TRIzol 试剂的比例加入TRIzol 试剂；

3. 用1 mL枪头反复吹打, 使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化；

4. 转移到RNase-free 的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应该为清亮而且不粘稠的状态；

5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。

悬浮细胞

6. 悬浮细胞培养或处理结束后，去除培养液；

7. 保留的细胞用PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液；

8. 按照每5×106 个细胞加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；

9. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。

血液

1. 在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀；

2. 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000 g 离心30 min；

3. 用移液枪小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清；

4. 加入白细胞20倍体积的TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；

5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。

三、总RNA 样品制备操作流程

1. 用于RNA 提取的试剂及其他物品必须为RNase-free 的，并且尽量在洁净、不通风的环境中进行实验。

2.应当选用自己熟悉的或公认可以得到良好实验结果的提取方法（如使用EasyExtract、TRIzol或RNeasy ）进行RNA 的提取。

3. 可以根据实际需要选择RNA 的保存方法：需要长期保存的RNA 样品保存于75％乙醇中；无需长期保存的RNA 样品保存于RNase-free 的双蒸水或Elution buffer 中，样品浓度不应低于3μg/μl (需要扩增的样品浓度不应低于0.2μg/μl)。

4. RNA质量，即A260/A280比值应在2左右，总RNA电泳检查需要有清晰的18s和28s rRNA条带，同时28s/18s的比例应在2：1以上，70°C 水浴保温1 小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

四、其他的样品处理方法

RNAlater

1．简介

RNAlater 是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA 于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater 中保存，而不会引起RNA 的降解，这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理。RNAlater 应保存在室温下，保质期6 个月。如放置在4℃条件下则会引起沉淀，此时需加热到37℃才可澄清。RNAlater 可广泛应用于多种脊椎动物样品。包括脑、心、肾、脾、肝、睾丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater 对大肠杆菌、果蝇、组织培养细胞、全血细胞和一些植物也有效。RNAlater 可与大多数RNA 提取方法相协调。特别是TRI Reagent., RNAwiz, TōTALLY RNA,RNAqueous, and Poly(A)Pure。

2. 如何使用RNAlater

RNAlater 只能用于新鲜组织，在浸入RNAlater 之前不能冷冻组织。简单切碎组织样品，任何一边的最大厚度不能大于0.5cm, 然后将组织碎块放入到5 倍体积的RNAlater 中保存。

动物组织

RNAlater 不会溶解或破坏组织样品的结构。如果需要的话，仍可将已经平衡在RNAlater 溶液中的组织取出并分割成更小的块再重新放入到RNAlater 中。小器官如鼠肝、肾和脾可以完整地保存在RNAlater 中。

植物组织

许多植物组织可以简单浸泡在5 倍体积的RNAlater 中保存。具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater 进入组织。

组织培养细胞

沉淀细胞，用PBS 洗一次，再用少量的PBS 悬浮细胞，然后加5~10 倍体积的RNAlater 保存。

白细胞

如果将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNAlater 中。不要将全血、血浆或血清中的RNA 保存在RNAlater 中，因为它们蛋白含量过高，与RNAlater 混合后易形成不溶的沉淀。

细菌

RNAlater 是抑菌的，虽然细菌在RNAlater 中不能生长，但细胞仍保持其完整性。大肠杆菌保存在RNAlater 中4℃条件下1 个月仍很完整，产生不降解的RNA。

3. RNAlater 中样品的保存

保存于-80℃

建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后从RNAlater 溶液中取出样品保存于-80℃。对于组织培养细胞，不必移去RNAlater，只需简单冻存整个溶液。实验证明，细胞在-80℃条件下冻存于 RNAlater 溶液中并未出现溶解。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。

保存于-20℃

建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后转移到-20℃。样品在-20℃条件下不会冻结，但在存贮缓冲液中会有结晶形成，这并不影响随后的RNA 提取。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA 的质和量都不会受到影响。

保存于4℃

目前尚无证据证明样品存于4℃ 1 个月内会出现RNA 降解。

如果没有冰箱：

将样品放在尽可能冷的环境中。如果周围温度超过25℃，应尽可能使RNAlater 中的样品冰浴数小时。

4. RNAlater 中样品的RNA 提取

组织

用消毒镊子将组织从存贮溶液RNAlater 中取出，浸泡在RNA 提取溶液中。一旦将组织放入RNA提取溶液中，匀浆一定要迅速进行。

细胞

从存贮在RNAlater 中的细胞中提取RNA 有两种操作方法可供选择：去除RNAlater 或者从细胞与RNAlater 的混合物中直接提取RNA。

5. 从RNAlater 中取出样品

去除RNAlater

因为RNAlater 的浓度比典型的细胞培养介质的浓度高，因此用通常沉淀活细胞的离心力无法沉淀RNAlater 中的细胞。离心沉淀细胞，去除RNAlater。（HeLa 细胞大约需要3000×g，但其他细胞可能不能容忍这个速度，或者他们需要更大的离心力。）

从RNAlater 中的细胞直接提取RNA

作为选择，我们可以用一步法破碎/提取溶液（如TRI Reagent 和RNAwiz）从没有去除RNAlater 的细胞中纯化RNA。这可通过向细胞混合物中加入10 倍体积的一步提取溶液完成，其他照常。

RNAsecure：

1.简介

在分子生物学试剂中用的RNAsecure 代替DEPC，有很多优点：

1) 可以加入到不能用DEPC 处理的溶液中（如：Tris 或MOPS 缓冲液）；

2) 可以加入到不能被高压灭菌的溶液中；

3) 可以加入到加酶之前的酶促反应中。有RNAsecure 试剂存在的如下酶促反应（先于酶加入）：RNA 多聚酶T7，T3 和SP6 的体外转录（37℃），MMLV 和AMV逆转录（42℃），以及SuperTaq PCR（94℃），均没有出现酶抑制现象。

2. 使用方法

1) 用缓冲液或经过处理的溶液稀释RNAsecure 试剂到1×，充分混匀。

2) 将混合物在60℃水浴温浴20 min，冷却至室温。这样的溶液可备用于接下来的RNA 提取和分析，或者保存于室温、4℃或-20℃以备将来使用。

3) 为了消除任何可能发生在经过初处理之后的RNA 酶的污染，在使用前可以将RNAsecure 溶液在60℃水浴中重新温浴10~20 分钟。

3. 注意事项

RNAsecure 试剂只在高于45℃的条件下才有活性，但当反应体系孵育温度超过该温度时可能会使一些酶失活。因此，用RNAsecure 处理反应缓冲液时要以加入酶之前做为临界点，然后进行酶促反应时孵育温度低于45℃。注意：这不适用于Taq 多聚酶。

五、样品制备常用仪器和试剂及耗材

1. 常用试剂及耗材

DEPC

TRIzol Reagent

氯仿：异戊醇

一次性注射器及针头

Qiagen RNeasy Mini kit

Qiagen RNAlater

Ambion RNAsecure Reagent

Tip（RNase-free）

微量离心管（RNase-free）

2.样品制备过程中使用物品的RNase-free处理

RNase-free 水：0.1%DEPC 处理（用磁力搅拌器搅拌过夜），高压灭菌。

氯仿

无水乙醇(新包装开封后注明RNA专用)

75%乙醇：用RNase-free 的水配制。

离心管和冷冻保存管以及Tip头浸泡在0.1%DEPC 水中过夜，干燥后高压灭菌。

其他玻璃或金属器具用铝箔纸包裹后180℃干烤过夜。

任何接触样品的操作需佩戴一次性手套,避免直接接触样品。