呵呵,提取RNA过程?

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）5、表面活性剂快速制备法：用TritonX-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。扩展资料：DNA提取原则：1、保证核酸一级结构的完整性；2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。参考资料来源：百度百科——DNA提取

这篇文章主要讲的是几种常用的RNA提取方法。 1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法 原理：使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，经过起始密度为1.78g/ml的氯化铯介质，进行密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清中。使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA. 本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本以及富含RNA酶的组织细胞（如胰腺）的RNA提取尤其适合。此法提取的RNA的质量好和成功率高，已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。其缺点是操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限。 2、盐酸胍-有机溶剂法 本法有MacDonald 1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的，适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA，提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。 3、氯化锂-尿素法 本法首先由Auffray报道，利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，3mol/L LiCl选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，LiCl沉淀RNA会丢失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。优点是快速简捷，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取，其质量可以满足Northern分析，Oligo（dT）提取mRNA，SI核酸酶或RNase保护实验等。本法每提取107个细胞能提取总RNA约10?g。 4、热酚法 本法主要用于少量细胞样品RNA提取，其产量不高，但简单易行。 5、快速提取法 本法主要用于培养细胞，通过0.5%SDS裂解细胞，酚抽提去除蛋白质和DNA沉淀，快速纯化RNA。 6、细胞质RNA提取法 本法主要适用于培养细胞，首先去除细胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白质，酚/氯仿抽提去除蛋白质。操作简单，同时能进行多个样品操作，多数步骤在室温下进行，提取的RNA质量较高，可满足体外无细胞翻译系统、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保护实验。本法提取的RNA产量一般为30～500?g/107个细胞。 7、酚-氯化锂法同时提取细胞RNA和DNA 本法是在Elion和Warner报道的方法基础上，有Sandeep等人于1990年改进而成。它通过酚和SDS裂解细胞，变性，解聚蛋白，抑制RNase，并用EDTA保护DNA，最后根据RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度，而分离DNA和RNA。整个过程在2小时内完成。RNA可用于Northern分析，DNA可用于内切酶消化以及Southern杂交实验。 8、一步快速热酚抽提法 基于Shomczynki和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法，美国Promega公司有机地将这些试剂组合成总RNA试剂盒，使操作更为简单方便，并突出体现以下几个优点：1）将已知最强的RNase抑制剂异硫氰酸胍、b-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离进入溶液，提高了RNA的提取产量；2）RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩，对大量或少量组织的细胞RNA提取，均甚合适；3）可在3小时以内处理大量样品，省略了氯化铯密度梯度超速离心步骤及其它方法使用的长时间选择性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但会导致小RNA（<5.8S）的丢失，而且Li+盐的残留还会抑制DNA的合成反应。

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料:抽提RNA的使用目的RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。因此，明确实验目的是进行后续实验的首要条件。参考资料来源:百度百科-RNA

细胞中的RNA主要有三类：rRNA约占80％－85％,tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%,mRNA约占1%-5%,由于rRNA占绝大多数,因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rRNA,它也有三种类型：28S,18S,5S.所以我们看到的也应该是三条带,而且28S的亮度为18S的两倍.这样的RNA才可以用来建库. 在RNA的提取时,一定要注意RNase的污染,因RNA极易被RNase的降解,操作时应尽量少说话,并在洁净的环境中操作,主要防止手、唾液和空气中Rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase,可以不经处理直接用于提取RNA,实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有Rnase污染,使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）,另外,由于材料不同,机体内含有的糖、酚类物质不一样,因此材料不同用的方法也应该不一样. 下面是两种提取方法,第一种适用于嫩组织或动物组织的总RNA的提取,第二种适用于老组织的提取. 试剂：提取缓冲液,KAc(5M),异丙醇,无水乙醇,DEPC水 仪器：离心机,恒温水浴锅,研钵 方法一 动物、植物（嫩叶）的总RNA分离 大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨 ↓ 加5mlTrizol裂解液 ↓ 12000rpm ,4度,10分钟 ↓ 加入1ml氯仿 ↓ 剧烈振荡15秒,室温温育2-3分钟 ↓ 室温离心10分钟,8000rpm ↓ 取上清,加入等体积的异丙醇,15-30度放置10分钟. ↓ 12000g离心10分钟 ↓ 弃上清,加入10ml75%洒精洗沉淀. ↓ 2-8度下,不超过7500g离心5分钟 ↓ 弃上清,干燥沉淀10分钟 ↓ 用DEPC水溶. 方法二 、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总RNA分离 1g组织液氮研磨,加入6ML提取缓冲液 ↓ 2min振荡 ↓ 65℃,20min ↓ 加入1.5MLKAc ↓ 混匀,冰浴20min ↓ 8000rpm,4℃,15min 取上清,加入0.6倍异丙醇,-20℃,1小时（或室温15-20min） ↓ 12000rpm,4℃,15min ↓ 75%乙醇,12000rpm,20℃,5min ↓ 晾干,溶60ulDEPC水,15min ↓ 12000rpm,4℃,5min,上清即为RNA.,10,需要防止RNA降解，用华越洋的外源RNA酶清除剂，处理耗材，器具，台面等。,0,RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些 稀碱法提取实验

1.10.5ml biog析出液加入59.5mL无水乙醇；18mL biog洗涤液加入42mL无水乙醇2.取无RNA酶的15mL离心管，加入7.5mLbiog结合液，再加入2.5ml的血液，震荡混匀 15秒，室温放置5分钟，5,000 rpm 离心 3分钟。3.彻底移去上清，加入625μLPBS，悬浮沉淀；加入2500 μLbiog裂解液，250μLbiog消化液，充分振荡混匀，56℃水浴10 分钟至细胞完全裂解。4.加入6250ul配置好的析出液，轻轻颠倒混匀。5.将吸附柱放入收集管内，将4813μL上述溶液转入吸附柱内，静置2分钟，5,000 rpm 离心2分钟，弃收集管内废液；6.将吸附柱放回收集管内，将剩余4813μL溶液转移至吸附柱内，重复上一步骤。7.将吸附柱放回收集管内，加5000 μL洗涤液至吸附柱内，5,000 rpm 离心1分钟，弃收集管内废液。8.将吸附柱放回收集管内，5,000 rpm 离心2分钟，离去残留的洗涤液。9.取出吸附柱，放入新的无RNA酶的15 mL 离心管内，加入250-400μL biog洗脱液，静置3 分钟，5,000 rpm离心2分钟，收集RNA溶液。提的RNA即可用于下一步实验或-20℃保存。

RNA 降解是非常严重的问题，在RNA提取过程中，为防止降解我们需要遵守以下4点基本规则： 基本规则 1. 把所有接触RNA 的塑料制品以及玻璃制品都高压灭菌。 2. 用于RNA 缓冲液的所有水都要经DEPC 处理。加DEPC 到终浓度0.1% ，再室温放放置过夜，或者灭菌15 min 。DEPC 不能用于Tris 缓冲液，因为DEPC 将会降解成乙醇和二氧化碳。 3. 避免碱性缓冲液，因为RNA 中的羟基对碱非常敏感。 4. 将RNA 缓冲液与其他缓冲液分开放置，避免用错或被RNases 污染。

需要准备的试剂：TRIzol（主要成分是苯酚）、氯仿（酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）、异丙醇、80%酒精（用RNase-free ddH2O配制）、RNase-free ddH2O。 实验流程 一、样品预处理（Sample Pretreatment） ①1毫升全血+1毫升RNase-free ddH2O。 ②RNA血液保存液12000rpm离心5min，弃上清后加1毫升RNase-free ddH2O。 ③200微升全血+1毫升RNase-free dd H2O。 ④500微升全血+1500微升TRIzol（样品体积的3倍），彻底混匀。 所有样品在15-30℃放置5min。①②③样品在4℃下，12000rpm离心10min。 二、匀浆处理（Homogenization） ①②③弃上清后加入1毫升TRIzol，混匀。将①②③④样品在室温下放置5min。在4℃下，12000rpm离心10min。取上清至新的2毫升离心管中，加入2倍体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），剧烈震荡15s，室温放置3min，使其自然分相。 注：加入TRIzol后，如不需后续实验，可将样品放至-70℃长期保存。 三、RNA沉淀（RNA Precipitation） 1.在4℃下，12000rpm离心10min。 注：样品会分三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相。RNA主要在水相中，把水相转移至新管中。不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染。 2.吸取上清至新的离心管中，加入等体积的冰异丙醇，室温放置20-30min。在4℃下，12000rpm离心10min。RNA沉淀于管底。 四、RNA漂洗（RNA Wash） 1.弃液体，加入与TRIzol相同体积的80%酒精（用RNase-free ddH2O配制），缓慢的上下颠倒，悬浮沉淀， 2.在4℃下，12000rpm离心3min。弃液体，室温放置30min（液体蒸发完即可，不宜放置太久，RNA样品过于干燥会很难溶解）。 五、溶解RNA（Redissolving the RNA） 沉淀中加入30-100微升RNase-free ddH2O，用枪头吹打混匀。-70℃长期保存。

Trizol作用原理：在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料RNA和DNA一样，也是由各种核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接构成的多核苷酸链，但与DNA有一系列差异。1、在化学组成方面，RNA含核糖而不含脱氧核糖。含尿嘧啶而不含胸腺密啶。例外的是，每个tNA分子含有一个胸腺嘧啶，这是在RNA链合成后由尿嘧啶甲基化生的，此外，前面已提到，少数DNA含有少量核糖，但这些个别的例外并不能以此否定两类核酸组成上的差异。2、RNA一级结构的概念虽与DNA相同.但其基本结构单位是核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸。此外，部分RNA5′端或3′端有特殊的核苷酸序列，而且RNA一级结构中没有DNA那样复杂的顺序组织。3、绝大多数RNA为单链分子，单链可自身折迭形成发夹（hairpin）样结构而有局部双螺旋结构的特征，这是各种RAN空间结构的共同特征。RNA局部双螺旋结构中碱基互补配对规律是A对U和G对C。由于RNA分子内部不能全面形成碱基配对，故其碱基克分子比A不等于U，G不等于C，不存在DNA碱基比例的 Chargaff规律。

由于RNAase的影响，为获得完整的基因RNA分子，必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNAase的活性，因RNAase非常稳定，可降解标本中的RNA，许多组织和细胞中都含有活性很高的RNAase，因此在纯化RNA的过程中要保证无RNAase污染。选择性地使用针对RNAase的蛋白质变性剂、蛋白水解酶和能与蛋白质结合的阴离子去污剂，并联合使用RNAase的特异性抑制剂能极大地防止内源性RNAase对RNA的水解。提取RNA的方法有硫氰酸胍分离法等。

最近要提取组织RNA，上网看了下其他前辈的经验贴，现将丁香园“丁香师兄”的经验贴整理如下。原文链接 https://www.biomart.cn/experiment/443/448/2282643.htm ，有删减 --自己的一些经验-- 之前都是在提细胞的RNA，用量一般是细胞瓶/6孔板的一个孔用1ml，12/24孔板用0.5。 彩艳姐的意思是，这个用量是足够多的，一般就按照这个量来加就可以了。后续异丙醇等按照trizol的用量来加。 操作过程中都是无酶的用具，冰上操作。 看完了丁香师兄的protocol和经验，发现了自己之前忽略的几个点： ①防止内源RNA酶的降解很重要，细胞要放在冰上，组织在液氮研磨成粉末并加 Trizol 之前不能化冻 ②足量trizol可防止组织中内源性RNA酶降解RNA，充分研磨对于防止RNA降解也是类似的道理 ③最后一步酒精洗涤可多加，充分反应，把RNA弹起来 关于配套试剂 Trizol 法提取 RNA 是要用到氯仿、异丙醇和乙醇的。氯仿遇光易分解，异丙醇虽然没有特殊说明，但我查的据说也是最好避光保存，不过这种试剂都是棕色瓶子，能遮蔽大部分的光线了。 关于实验时的防护： RNA 很容易降解，所以实验时一般都要求口罩帽子的，避免组织的污染。不过以我的经验，好像内源性的 RNA 酶才是最主要的，也就是组织内本身的 RNA 酶。开始我是很小心，但是提取出来发现还是降解了，后来有经验了，即使组织掉在地上，拿回去继续提也没问题（前提是不能化冻）。所以最最重要的是组织在液氮研磨成粉末并加 Trizol 之前不能化冻，这也是 fast200 法提取效果不好的原因（fast200 法一般不用液氮研磨）。 关于液氮研磨 万事开头难，液氮研磨是最开始的步骤，也是最辛苦的步骤。很多女孩子都怕液氮，毕竟是零下近 200 度的东西，当然不是闹着玩的。不过只要小心操作，一般没啥问题，我提了一个多月的 RNA，对液氮是很亲切了，呵呵。我是找了一个保温杯，倒出一些液氮，然后再往研钵里倒。研磨的时候多加几次液氮，组织会慢慢变脆，就会好研一些，对于一些含水量比较大，很硬的组织，我是准备了刀片，切成小块后再研磨，一定研磨充分，不要求研磨成奶粉状，但至少得看不到明显的颗粒，这样 Trizol 才能充分和组织接触，快速裂解组织，也能防止组织的降解（Trizol 内含 RNA 酶抑制剂）。 关于组织量 研磨前最后称一下组织的重量，毕竟 1 ml 的 Trizol 最多只能裂解 100 mg 的组织。 Trizol 里面是含有 RNA 酶抑制剂的，如果组织过量，Trizol 无法完全浸润组织无法完全裂解组织，多余组织内的 RNA 酶等物质会导致 RNA 的降解。这是 RNA 降解的很重要的原因。 关于提取步骤 标准 Trizol 提取步骤为 液氮研磨--加入 Trizol 裂解--加入氯仿抽提--离心--加入氯丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心。 因为提取的组织，在加入 Trizol 后增加了一步简短的离心，可以帮助去掉一些无法降解的组织，比如纤维和杂质之类，然后取上清再加入氯仿，可以帮助提高氯仿的效率。然后就是在加入 Trizol 后，可以将裂解液放到-80 冻存半小时以上，据说冻融过程中可以再次帮助更加充分的裂解细胞，分离蛋白和 RNA。我试了一下，的确有效果。 关于个步骤的时间 标准的时间是： a. 液氮研磨（没时间要求，只要组织不化就好, 我一般一个组织十分钟左右，女孩子可能时间长一些，毕竟体力活） b. 加入 Trizol 裂解 5-10 分钟（我觉得还是 10 分钟比较好，有人说这步要放在冰上，但是我的经验室温就可以，室温更有利于 Trizol 完全发挥作用，而且毕竟 Trizol 含有 RNA 酶抑制剂，不用担心 RNA 降解） c. 加入氯仿室温静置 15 分钟（国产试剂真是坑爹啊，说明书把这步时间缩短到 3 分钟，出来效果奇差） d. 离心 15 分钟，这是管见的一步，离心后分成三层，RNA 在上清里，所以离心管从离心机拿出来的时候要轻巧，以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定一定轻，切忌吸取太多，少量即可，洗到 400-500ul 就 OK 了，再多就容易碰到下层沉淀了。 e. 加入异丙醇静置 10 min，然后离心 10 min。 f. 用 75% 酒精洗涤沉淀，帮助分离剩余的有机试剂（剩余有机试剂过多会影响 OD 值和 PCR反应），所以酒精尽量多加一些，一般说明书没有说明这一步的时间，只是说剧烈涡旋震荡，我的经验是一定把沉淀弹起来，让浮在酒精中，然后放 1-2 min，让酒精充分接触沉淀，充分溶解有机试剂，然后再离心。 g. 加入 DEPC 处理水，组织提取出来的量还是挺大的，虽然不是很纯，所以溶解液还是不能太少，至少要 50ul，之前一个大姐给我说加 20ul 就可以，结果浓度直接高得光度计测不出来了。而且浓度太高跑电泳时也跑不开，没法鉴定。

您好，现在这个行业发展的不错，生物实验技术外包也会跟着发展，比如一些高校或者企业部分实验不想自己内部开展，或者涉及的设备比较昂贵，技术要求高，都会寻求外包。但是现在竞争也比较大，的得看单位这边整体做的怎么样。其次要看下你选择单位的规模如何，上海这边的，你可以看下基尔顿生物。

最常用的传统 TRIzol 法

1．提取称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。2．分离将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。3．沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时，用6mol／L HCI 小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。 4．洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000r／min离心 10min，得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内，用95％的乙醇 5～10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次。5．干燥从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。

RNA提取步骤及注意事项（仅供参考）：实验步骤如下：1.取50—100mg的组织,加入1ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)。2.将匀浆室温放置5min。3.加入200μl氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min。4.12000rpm，4℃离心15min。5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中（取400μl），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。）6.12000rpm，4℃离心15min。7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的）9.8000rpm，室温离心10min。10.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。11.真空离心干燥3—5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。12.沉淀用30μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10min。13.RNA检测(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/ml RNA计算RNA的产量。OD260/OD280在1.8-2.0。(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。注意事项：1.获得RNA效率低有一下原因a:样品裂解或匀浆处理不彻底b:最后得到地RNA沉淀未完全溶解2.A260/A280＜1.65原因a:检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下，A280值会较高b:样品匀浆时加地试剂量太少c:匀浆后样品未在室温放置2分钟d:水相中混有有机相e:最后得到地RNA沉淀未完全溶解3.RNA降解原因a:组织取出后没有马上处理或冷冻b:样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度，未在-60--70度保存c:细胞在胰酶处理时被破坏d:溶液或离心管未经RBase去处理

我的实验是从血清中提取microRNA, 用过biog的，结果还可以。

分子克隆技术（华农） 实验一 质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。 实验原理：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验步骤： 1. 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养； 2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养； 3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 4. 加入300 ml溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； （剧烈） 5. 加入300 ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟； 6. 加入300 ml溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；（温和） 7. 12000 g离心10分钟； 8. 吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟； 9. 12000 g 常温离心15分钟； 10. 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）； 11. 室温放置或超净台上风干DNA； 12. 加40 ml灭菌超纯水或TE溶解； 13. 质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。 附注：质粒检测 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA

常见的RNA提取方法有苯酚法、阴离子去污剂法、LiCl一尿素法、改良的Gomez法、异硫氢酸胍法、CTAB法、热硼酸法及改良热硼酸法、TRIZOL试剂快速提取法。RNA提取时，就变性剂的选择来说，CTAB（CTAB法）比异硫氰酸胍（RIZOL试剂法）和　SDS（改良热硼酸法）更有效；就CTAB法来说，由于以CTAB为变性剂，同时加入PVP和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离出RNA。

现在常用的是Trizol法。提前将研钵、研棒、剪刀、镊子等用锡箔纸包好200度烘烤6小时，与实验前放到冰箱中预冷。枪头、离心管等DEPC水浸泡处理12小时后，高温灭菌30分钟（也可不用DEPC处理，常规高温灭菌40分钟），整个处理过程必须带手套（最好带口罩），否则环境中的RNA酶会降解RNA。1、取鲜样或者在-80度保存样品，液氮研磨样品至细小粉末，0.1g样品加入1mlTrizol混匀，室温静置5分钟。2、12000rpm离心十分钟，取上清至一新的离心管中，加入0.2ml氯仿剧烈晃动15秒，室温静置2-3分钟3、12000rpm离心十分钟，取上清至一新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置10分钟4、12000rpm离心十分钟，去除上清，用70%乙醇清洗2次，7500rpm离心五分钟，晾干。（不可过分干燥否则不易溶解）5、加入适量DEPC水溶解沉淀

一般按试剂盒操作说明进行即可，如果怀疑有DNA污染，可用DNArase处理，去掉残留DNA。

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候

方法：1、使用DNA酶DNAse I 消化1小时，恒温37度。2、离心取上清的时候，一定要小心不要取到中间的膜和下面的液体。3、直接加NaOH溶液与提取液混合搅拌,然后离心就可以了.因为RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,离心后的上清液就不含有DNA了。

Trizol法1、将组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml的Trizol液研磨；每2E6个细胞加入1mLTrizol。注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2、研磨液室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，静置5min，12,000rpm离心5min。3、取上层水相于一新的离心管，按每1ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，剧烈振摇使混匀，4℃，12,000rpm离心10min。4、弃去上清液，按每1ml Trizol液加入至少1ml的比例加入70%乙醇，涡旋混匀 ，4℃×7,500rpm×5min。5、重复以上步骤。6、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，加入30μL RNase Free的水中。7、电泳检测。

[思路分析]：①取鸡血细胞液（其红细胞椭圆具核，除骆驼外，猪、羊、狗等哺乳动物红细胞无核），或取新鲜猪肝、菜花、洋葱等材料。虽然在细菌的转化实验中提取的是无核细胞中的DNA，但一般而言，均是从具核的生物材料中提取DNA。当然，在提取出的DNA中也含有一定量的胞质DNA，即线粒体DNA和叶绿体DNA。值得推介的材料是洋葱，取材容易，操作简便，效果明显。将家用加盐洗洁精与洋葱碎屑混合研磨并过滤后，再加酒精，微摇后即出现白色的毛絮状DNA混合物。②使红细胞溶血破膜以及化学药剂十二烷基磺酸钠 SDS（洗洁精的主要成分）或三氯乙酸溶膜。在低渗溶液中，如加蒸馏水使血细胞过度渗透吸水直至破裂，同时用玻棒加速血细胞及核破裂，经一级过滤后滤出液为DNA核蛋白和RNA核蛋白。对于菜花、洋葱等植物材料，在研磨破坏其细胞壁的同时，可考虑适量加入乙二胺四乙酸EDTA以防止DNA酶解。③利用DNA和RNA溶解度的不同析出DNA。在浓氯化钠溶液（2 mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，而RNA核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠溶液（0.14mol／L）中DNA的溶解度最低，蛋白质的溶解度很高而出现盐溶现象，经二级过滤后滤出液主要为DNA粗制品。④DNA不溶于酒精，经三级过滤后，再利用乙醇沉淀法使其他物质溶于酒精而进一步纯化DNA。⑤二苯胺或甲基绿鉴定法即DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成蓝色，遇甲基绿被染成蓝绿色，且颜色的深浅与DNA纯化程度有关。在此过程中设计对照实验，以增强实验中二苯胺对DNA专一性显色结果的可信度。

、组织样品采集1. 首先准备好用于包装样品的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样品编号。2. 准确切除所需组织。3. 离体新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。4. 在RNase-free 的0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。5. 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。6. 把样品袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织，样品较多时应分装至多个小袋，不要在一只样品袋中放过多的样品以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘2 张标签纸（标签上注明：客户名、样品名称、编号、日期，粘2 张标签纸是为了防止标签脱落造成样品混乱），迅速转入液氮罐。7. 填写样品登记单，写明样品名称、组织类型、编号、取样日期、样品处理过程等情况。注意事项1. 对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。2. 不要用 Eppendorf 管保存组织样品，因为 Eppendorf 管从液氮中取出时极易发生爆裂而造成样品损失。3. 步骤 2～5应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品RNA降解 。4. 在临床手术过程中采集的病理或正常样品，如果没有条件立即从手术室中取出进行后续处理，请在切除后立即转移到液氮中保存。二、细胞及血液样品采集贴壁细胞1. 贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液；2. 按每10 cm2 培养面积加1 mL TRIzol 试剂的比例加入TRIzol 试剂；3. 用1 mL枪头反复吹打, 使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化；4. 转移到RNase-free 的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应该为清亮而且不粘稠的状态；5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。悬浮细胞6. 悬浮细胞培养或处理结束后，去除培养液；7. 保留的细胞用PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液；8. 按照每5×106 个细胞加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；9. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。血液1. 在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀；2. 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000 g 离心30 min；3. 用移液枪小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清；4. 加入白细胞20倍体积的TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。三、总RNA 样品制备操作流程1. 用于RNA 提取的试剂及其他物品必须为RNase-free 的，并且尽量在洁净、不通风的环境中进行实验。2.应当选用自己熟悉的或公认可以得到良好实验结果的提取方法（如使用EasyExtract、TRIzol或RNeasy ）进行RNA 的提取。3. 可以根据实际需要选择RNA 的保存方法：需要长期保存的RNA 样品保存于75％乙醇中；无需长期保存的RNA 样品保存于RNase-free 的双蒸水或Elution buffer 中，样品浓度不应低于3μg/μl (需要扩增的样品浓度不应低于0.2μg/μl)。4. RNA质量，即A260/A280比值应在2左右，总RNA电泳检查需要有清晰的18s和28s rRNA条带，同时28s/18s的比例应在2：1以上，70°C 水浴保温1 小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。四、其他的样品处理方法RNAlater1．简介 RNAlater 是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA 于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater 中保存，而不会引起RNA 的降解，这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理。RNAlater 应保存在室温下，保质期6 个月。如放置在4℃条件下则会引起沉淀，此时需加热到37℃才可澄清。RNAlater 可广泛应用于多种脊椎动物样品。包括脑、心、肾、脾、肝、睾丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater 对大肠杆菌、果蝇、组织培养细胞、全血细胞和一些植物也有效。RNAlater 可与大多数RNA 提取方法相协调。特别是TRI Reagent., RNAwiz, TōTALLY RNA,RNAqueous, and Poly(A)Pure。2. 如何使用RNAlater RNAlater 只能用于新鲜组织，在浸入RNAlater 之前不能冷冻组织。简单切碎组织样品，任何一边的最大厚度不能大于0.5cm, 然后将组织碎块放入到5 倍体积的RNAlater 中保存。动物组织 RNAlater 不会溶解或破坏组织样品的结构。如果需要的话，仍可将已经平衡在RNAlater 溶液中的组织取出并分割成更小的块再重新放入到RNAlater 中。小器官如鼠肝、肾和脾可以完整地保存在RNAlater 中。植物组织 许多植物组织可以简单浸泡在5 倍体积的RNAlater 中保存。具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater 进入组织。组织培养细胞 沉淀细胞，用PBS 洗一次，再用少量的PBS 悬浮细胞，然后加5~10 倍体积的RNAlater 保存。白细胞 如果将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNAlater 中。不要将全血、血浆或血清中的RNA 保存在RNAlater 中，因为它们蛋白含量过高，与RNAlater 混合后易形成不溶的沉淀。细菌 RNAlater 是抑菌的，虽然细菌在RNAlater 中不能生长，但细胞仍保持其完整性。大肠杆菌保存在RNAlater 中4℃条件下1 个月仍很完整，产生不降解的RNA。3. RNAlater 中样品的保存保存于-80℃ 建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后从RNAlater 溶液中取出样品保存于-80℃。对于组织培养细胞，不必移去RNAlater，只需简单冻存整个溶液。实验证明，细胞在-80℃条件下冻存于 RNAlater 溶液中并未出现溶解。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。保存于-20℃ 建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后转移到-20℃。样品在-20℃条件下不会冻结，但在存贮缓冲液中会有结晶形成，这并不影响随后的RNA 提取。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA 的质和量都不会受到影响。保存于4℃ 目前尚无证据证明样品存于4℃ 1 个月内会出现RNA 降解。如果没有冰箱： 将样品放在尽可能冷的环境中。如果周围温度超过25℃，应尽可能使RNAlater 中的样品冰浴数小时。4. RNAlater 中样品的RNA 提取组织 用消毒镊子将组织从存贮溶液RNAlater 中取出，浸泡在RNA 提取溶液中。一旦将组织放入RNA提取溶液中，匀浆一定要迅速进行。细胞 从存贮在RNAlater 中的细胞中提取RNA 有两种操作方法可供选择：去除RNAlater 或者从细胞与RNAlater 的混合物中直接提取RNA。5. 从RNAlater 中取出样品去除RNAlater 因为RNAlater 的浓度比典型的细胞培养介质的浓度高，因此用通常沉淀活细胞的离心力无法沉淀RNAlater 中的细胞。离心沉淀细胞，去除RNAlater。（HeLa 细胞大约需要3000×g，但其他细胞可能不能容忍这个速度，或者他们需要更大的离心力。）从RNAlater 中的细胞直接提取RNA 作为选择，我们可以用一步法破碎/提取溶液（如TRI Reagent 和RNAwiz）从没有去除RNAlater 的细胞中纯化RNA。这可通过向细胞混合物中加入10 倍体积的一步提取溶液完成，其他照常。RNAsecure：1.简介在分子生物学试剂中用的RNAsecure 代替DEPC，有很多优点：1) 可以加入到不能用DEPC 处理的溶液中（如：Tris 或MOPS 缓冲液）；2) 可以加入到不能被高压灭菌的溶液中；3) 可以加入到加酶之前的酶促反应中。有RNAsecure 试剂存在的如下酶促反应（先于酶加入）：RNA 多聚酶T7，T3 和SP6 的体外转录（37℃），MMLV 和AMV逆转录（42℃），以及SuperTaq PCR（94℃），均没有出现酶抑制现象。2. 使用方法1) 用缓冲液或经过处理的溶液稀释RNAsecure 试剂到1×，充分混匀。2) 将混合物在60℃水浴温浴20 min，冷却至室温。这样的溶液可备用于接下来的RNA 提取和分析，或者保存于室温、4℃或-20℃以备将来使用。3) 为了消除任何可能发生在经过初处理之后的RNA 酶的污染，在使用前可以将RNAsecure 溶液在60℃水浴中重新温浴10~20 分钟。3. 注意事项 RNAsecure 试剂只在高于45℃的条件下才有活性，但当反应体系孵育温度超过该温度时可能会使一些酶失活。因此，用RNAsecure 处理反应缓冲液时要以加入酶之前做为临界点，然后进行酶促反应时孵育温度低于45℃。注意：这不适用于Taq 多聚酶。五、样品制备常用仪器和试剂及耗材1. 常用试剂及耗材DEPCTRIzol Reagent氯仿：异戊醇一次性注射器及针头Qiagen RNeasy Mini kitQiagen RNAlaterAmbion RNAsecure ReagentTip（RNase-free）微量离心管（RNase-free）2.样品制备过程中使用物品的RNase-free处理RNase-free 水：0.1%DEPC 处理（用磁力搅拌器搅拌过夜），高压灭菌。氯仿无水乙醇(新包装开封后注明RNA专用)75%乙醇：用RNase-free 的水配制。离心管和冷冻保存管以及Tip头浸泡在0.1%DEPC 水中过夜，干燥后高压灭菌。其他玻璃或金属器具用铝箔纸包裹后180℃干烤过夜。任何接触样品的操作需佩戴一次性手套,避免直接接触样品。

不是吧，dna是有组蛋白结合的，结合部位不能被分解。 应该是这样的。。

罗氏？你买盒子了 没说明书么？

对于贴壁培养的细胞，可将培养基吸出后直接向培养板中加入Trizol来溶解细胞，然后分次移出细胞裂解物进行后续操作即可，一般个人习惯用biog提取

不需要

大多数真核细胞mRNA的3"端通常具有由20-30个腺苷酸组成的polyA尾巴，寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合，这就是提取mRNA最基本的原理。具体到实验手段上，现在磁珠法、纤维素柱层析法都有在用。磁珠法一般是用生物素标记OligoT，亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）。实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体，此复合体又与标有亲和素的磁珠结合。用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来。最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即可。寡聚dT纤维素柱层析法的大致流程：总RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液中，带polyA尾的mRNA被特异地结合在柱上。降低盐浓度，mRNA被洗脱。一般过两次柱后，就可得到较高纯度的mRNA。 当然有些mRNA没有polyA尾巴，这种就比较难办了，我最近的实验就是在对付这种东西。如果你是拿mRNA做RT-PCR，其实一般是不必分离mRNA的，设计好引物就可以用总RNA做了。

tfrgft

电泳或凝胶色谱法

因为很多病毒没有DNA，以RNA作为唯一的遗传信息载体。简单的说，绝大部分生物以DNA作为遗传信息的载体，而RNA将DNA上的遗传信息具体翻译并制造成蛋白质。真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。

BIODAI离心法对于拭子的处理，向1.5mL离心管中加入800μL生理盐水，将拭子收集的样本置于生理盐水中，涮洗20秒，使细胞完全脱落，贴离心管壁挤干拭子上的液体，12,000 rpm 离心5 min，弃700 μL上清，剩余100μL上清，充分振荡混匀15秒。

小麦总RNA的提取实验目的从黄化小麦苗中提取总RNA，可以为cDNA文库的构建做好准备。我们重点是要保证RNA的完整性、产率、防止修饰和纯度，尤其是完整性、防止修饰和纯度。RNA是单链，2"OH是它的化学性质远比DNA活泼。所以，提取RNA颇为不易。加之RNA的不均一性，要将所有的RNA（rRNA、tRNA、mRNA）完全提出，更加有挑战性。而Rnase是无处不在的（这种酶遇高温后也不会丧失活性，复性容易，在胞内外都有分布，不需激活，不需要二价金属离子的配合）；RNA还最怕DNA污染，因为若做RT-PCR，DNA的存在会降低产物的纯度和效率所有以上的因素都构成了我们成功提取RNA的障碍。但是我们可以不用考虑RNA的机械剪切，因为RNA通常较小，一般不会受到机械剪切的影响。实验原理及过程实验步骤实验原理1所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。去除RNA酶（外源）的影响。高温灭菌两次可以破坏RNA酶的复性过程.虽然RNA酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA酶失活。DEPC是RNA酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA酶失活。因为DEPC能与RNA的N结合，从而修饰RNA，所以，必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。（UV也能修饰RNA，实验时应避免。）DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。2在一灭菌2mL管中加入:5mol/L异硫氰酸胍0.7mL苯酚0.4mL2mol/LNaAc(pH4.0)0.1mL必须提前准备好变性剂。异硫氰酸胍可以变性RNA酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以是RNA酶有活性。NaAc酸性可以使DNA在有机相（酚相）中，而在碱性条件下，DNA和RNA都在水相中，无法分离，所以，Ph在本是严重很关键。苯酚用于抽提DNA和蛋白质。3称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中。剧烈震荡。低温防止内源性RNA酶降解RNA。剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对来说高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA没有水解RNA的机会。小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。4混匀,冰浴30min。54℃,12000rpm,10min。6上清至另一离心管中加0.4Ml氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。去脂类。740C,12000rpm,10min。8弃有机相（下层）加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室温放置5min。去脂类和蛋白质。940C,12000rpm,10min弃有机相，加入等体积异丙醇。-200C放置1h。去糖，脱水。因为体系高盐（2mol/LNaAc），所以可以使RNA沉淀。1040C,12000rpm,10min沉淀用70%乙醇洗两次。因为提出的量很少，可能不可见，所以离心是要有方向标记。11室温稍干燥。RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。12沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存)DEPC水中不含RNA酶。13RNA电泳：1％琼脂糖胶20mL8μL样品1μL样品缓冲液1μLSYBR100V恒压电泳测OD260和OD260／OD280

鸟枪法

先看下你的样本，是组织，血液，细胞等。如果是组织还要考核下具体组织样本，比如说有些含有脂肪含量很高，有些纤维含量很高，都会影响结果的。最后目前一般都是采用有针对性的试剂盒进行提取。

1．提取称取鲜酵母159或干酵母粉2.5g，倒入100ml三角瓶中，加NaCl2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。2．分离将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。3．沉淀RNA将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时，用6mol／LHCI小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。4．洗涤和抽滤上述悬浮液以4000r／min离心10min，得到RNA沉淀。将沉淀物放在10ml小烧杯内，用95％的乙醇5～10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用95％乙醇5～10ml淋洗3次。5．干燥从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。

DNA不是单独存在于细胞中的，是染色体蛋白质是有机物没错，但是它是复杂的有机物，有亲水基，疏水基，所以不是只要是有机物就溶于有机溶剂的分层看的是密度，不是分子量的大小

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。参考资料来源：百度百科-RNA

你要干什么.国家实验室的攻关课题你想在网上下啊.没有庞大的金钱和技术支持根本别想触及着方面.

rna提取的流程和方法如下：1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法。原理：使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，经过起始密度为1.78g/ml的氯化铯介质，进行密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清中。使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA.本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本以及富含RNA酶的组织细胞（如胰腺）的RNA提取尤其适合。此法提取的RNA的质量好和成功率高，已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。其缺点是操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限。2、盐酸胍-有机溶剂法。本法有MacDonald 1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的，适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA，提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。3、氯化锂-尿素法。本法首先由Auffray报道，利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，3mol/L LiCl选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，LiCl沉淀RNA会丢失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。优点是快速简捷，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取，其质量可以满足Northern分析，Oligo（dT）提取mRNA，SI核酸酶或RNase保护实验等。本法每提取107个细胞能提取总RNA约10?g。4、热酚法。本法主要用于少量细胞样品RNA提取，其产量不高，但简单易行。5、快速提取法。本法主要用于培养细胞，通过0.5%SDS裂解细胞，酚抽提去除蛋白质和DNA沉淀，快速纯化RNA。6、细胞质RNA提取法。本法主要适用于培养细胞，首先去除细胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白质，酚/氯仿抽提去除蛋白质。操作简单，同时能进行多个样品操作，多数步骤在室温下进行，提取的RNA质量较高，可满足体外无细胞翻译系统、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保护实验。本法提取的RNA产量一般为30～500?g/107个细胞。7、酚-氯化锂法同时提取细胞RNA和DNA。本法是在Elion和Warner报道的方法基础上，有Sandeep等人于1990年改进而成。它通过酚和SDS裂解细胞，变性，解聚蛋白，抑制RNase，并用EDTA保护DNA，最后根据RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度，而分离DNA和RNA。整个过程在2小时内完成。RNA可用于Northern分析，DNA可用于内切酶消化以及Southern杂交实验。8、一步快速热酚抽提法。基于Shomczynki和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法，美国Promega公司有机地将这些试剂组合成总RNA试剂盒，使操作更为简单方便，并突出体现以下几个优点：1）将已知最强的RNase抑制剂异硫氰酸胍、b-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离进入溶液，提高了RNA的提取产量；2）RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩，对大量或少量组织的细胞RNA提取，均甚合适；3）可在3小时以内处理大量样品，省略了氯化铯密度梯度超速离心步骤及其它方法使用的长时间选择性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但会导致小RNA（<5.8S）的丢失，而且Li+盐的残留还会抑制DNA的合成反应。

提RNA 加TRIZOL 室温静置5分钟 再加氯仿4°离心15分钟 去上层澄清相 再加异丙醇 -20放置30分钟 然后4°离心10分钟 倒掉液体 加酒精4°离心5分钟 然后倒掉酒精 晾干 加DEPC水溶解

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

提取得到具有生物学活性的RNA的方法：1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。在过去的十年中RNA-Seq技术迅速发展，并成为了在转录组水平上分析差异基因表达/mRNA可变剪切的不可缺少的工具。随着下一代测序技术的发展，RNA-Seq技术应用范围变得更加广泛：在RNA生物学领域，RNA-Seq可以应用于单细胞基因表达/蛋白质表达/RNA结构的分析；空间转录组的概念也逐渐兴起。

1OD =40μg/ ml。rna提取率计算公式为1OD =40μg/ ml。将2μl样品稀释至200μl，稀释倍数为100x，因此提取的RNA浓度为0.154×100×40μg/ ml =616μg/ ml。由于RNA量为50μl，提取的RNA总量为616μg/ ml×50 / 1000ml =30.8μg。

1. 保证细胞数量要足够，提取的时候细胞应该铺70%以上.2.细胞裂解很关键，详细按照试剂盒的要求操作，保证有足够的裂解时间。3.试剂使用要规范，要严格使用进口无RNA酶的枪头进行操作。4.特此强调洗脱RNA的水一定要干净无RNA酶。如果还不能提取出来，可以更换提取方法，比如TRZOL法或者更换试剂盒

细胞中的rna主要有三类：rrna约占80％－85％，trna和核内小分子rna约占10%-15%，mrna约占1%-5%，由于rrna占绝大多数，因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rrna，它也有三种类型：28s，18s，5s。所以我们看到的也应该是三条带，而且28s的亮度为18s的两倍。这样的rna才可以用来建库。在rna的提取时，一定要注意rnase的污染，因rna极易被rnase的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止手、唾液和空气中rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%depc溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无rnase,，可以不经处理直接用于提取rna，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有rnase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品），另外，由于材料不同，机体内含有的糖、酚类物质不一样，因此材料不同用的方法也应该不一样。下面是两种提取方法，第一种适用于嫩组织或动物组织的总rna的提取，第二种适用于老组织的提取。试剂：提取缓冲液，kac(5m),异丙醇，无水乙醇，depc水仪器：离心机，恒温水浴锅，研钵方法一动物、植物（嫩叶）的总rna分离大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨↓加5mltrizol裂解液↓12000rpm，4度，10分钟↓加入1ml氯仿↓剧烈振荡15秒，室温温育2-3分钟↓室温离心10分钟，8000rpm↓取上清，加入等体积的异丙醇，15-30度放置10分钟。↓12000g离心10分钟↓弃上清，加入10ml75%洒精洗沉淀。↓2-8度下，不超过7500g离心5分钟↓弃上清，干燥沉淀10分钟↓用depc水溶。方法二、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总rna分离1g组织液氮研磨，加入6ml提取缓冲液↓2min振荡↓65℃，20min↓加入1.5mlkac↓混匀，冰浴20min↓8000rpm,4℃,15min取上清，加入0.6倍异丙醇，-20℃，1小时（或室温15-20min）↓12000rpm,4℃,15min↓75%乙醇，12000rpm,20℃,5min↓晾干，溶60uldepc水，15min↓12000rpm,4℃,5min,上清即为rna。

大多数真核细胞mRNA的3"端通常具有由20-30个腺苷酸组成的polyA尾巴,寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合,这就是提取mRNA最基本的原理.具体到实验手段上,现在磁珠法、纤维素柱层析法都有在用. 磁珠法一般是用生物素标记OligoT,亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）.实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体,此复合体又与标有亲和素的磁珠结合.用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来.最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即可. 寡聚dT纤维素柱层析法的大致流程：总RNA流经寡聚dT纤维素柱时,在高盐缓冲液中,带polyA尾的mRNA被特异地结合在柱上.降低盐浓度,mRNA被洗脱.一般过两次柱后,就可得到较高纯度的mRNA. 当然有些mRNA没有polyA尾巴,这种就比较难办了,我最近的实验就是在对付这种东西.如果你是拿mRNA做RT-PCR,其实一般是不必分离mRNA的,设计好引物就可以用总RNA做了.

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

rna．提取 称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g,倒入 100ml三角瓶中,加 NaCl 2.5g,水25ml,搅拌均匀,置于沸水浴中提取lh. 2．分离 将上述提取液用自来水冷却后,装入大离心管内,以4000r／min离心10min,使提取液与菌体残渣等分离. 3．沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内,并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时,用6mol／L HCI 小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）.调好后继续于冰水中静置10min,使沉淀充分,颗粒变大. 4．洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000r／min离心 10min,得到 RNA沉淀.将沉淀物放在 10ml小烧杯内,用95％的乙醇 5～10ml充分搅拌洗涤,然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤,再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次. 5．干燥 从布氏漏斗上取下沉淀物,放在6cm表面皿上,铺成薄层,置于80℃烘箱内干燥.将干燥后的RNA制品称重,存放于干燥器内. 应该是这里的某个步骤错了吧!