pcr发现引物p出两条,qpcr一定结果不好吗

别的组的同学用的引物跟你的引物是一样的吗？如果一样的话，那就要考虑您的模板质量的问题了。如果扩增不成功，电泳图的底部都会有引物的条带。

1. 引物二聚体是引物3端不匹配放大形成的。 2. 引物二聚体的出现是必然的，但这或多或少是个问题。电泳时引物二聚体带的缺失并不意味着没有二聚体，而是其含量低，我们肉眼是看不到的。提高PCR的严格程度(包括提高退火温度和降低引物浓度)可以大大降低二聚体的浓度。

首先在设计引物的时候,要注意避免产生引物二聚体.现在的引物设计软件都会有一个dimer的选项,可以看出你设计的引物是否会发生二聚体.如果会形成二聚体,并且序列不能有大的变动,那就注意一下在3"端别发生dimer的互补. 其次,在PCR时提高退火温度可以提高PCR的特异性,可以减少引物二聚体.

1、引物二聚体是引物的3端间相互错配扩增形成的。 2、引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们 的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。

不会，引物二聚体的产生原因是引物之间存在大量的碱基互补配对的情况，引物在PCR过程已被消耗，放置中不会新增二聚体。在PCR体系中减少引物用量，或者提高退火温度可减少二聚体的产生。

引物二聚体的位置会变化。在PCR扩增反应的退火步骤中，引物二聚体结构会被局部地破坏，然后在下一个延伸步骤中被重组。因此，引物二聚体的位置不是固定不变的，而是会在PCR的不同步骤和不同条件下变化。

首先在设计引物的时候,要注意避免产生引物二聚体.现在的引物设计都会有一个dimer的选项,可以看出你设计的引物是否会发生二聚体.如果会形成二聚体,并且序列不能有大的变动,那就注意一下在3"端别发生dimer的互补. 其次,在PCR时提高退火温度可。

1、非特异扩增产物的大小通常是错误的。因此，可以通过电泳分离PCR产物并进行大小分析，以确定是否存在非特异扩增。2、引物二聚体的产生通常是由于引物序列之间的互补性过高，因此可以通过改变引物序列的设计，使其互补性降低，减少引物二聚体的发生。

其实在设计的时候，能够从软件上看到，产生二聚体的位置，就是两条引物上，哪里发生了互补。通常如果用Primer设计的话，我们认为一般互补碱基数在6个一下，且主要以AT组成的话，通过提高退火温度就可以解决引物二聚体的问题。但是如果这两条引物互补碱基数过多，且又以GC为主的话，就得要稍微前后挪动引物的物质，避开这段区域，因为如果两条引物各自挪动一点的话，可以尽量避开这个位置。我个人不是很建议修改碱基，因为如果引物是严格与模板互补的，由于这种修改，可能会导致引入突变位点，导致最后的实验结果有误。如果确认修改序列今后会被切掉，或者确实不影响，就将互补的碱基做一个替换，防止互补。

首先在设计引物的时候,要注意避免产生引物二聚体.现在的引物设计软件都会有一个dimer的选项,可以看出你设计的引物是否会发生二聚体.如果会形成二聚体,并且序列不能有大的变动,那就注意一下在3"端别发生dimer的互补.其次,在PCR时提高退火温度可以提高PCR的特异性,可以减少引物二聚体.

会。根据查询引物二聚体相关信息得知，引物二聚体会使主带弥散，条带越短，弥散越严重，由于引物二聚体很短，在NGS文库的磁珠纯化过程中，大部分引物二聚体溶解于水相而被去除，只要引物二聚体被去除干净了，就不会弥散了。

1从引物自身 着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法;2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量;3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可 降低它们的浓度;4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引 物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可 以增强特异性;6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的 引物合成为二聚体。7.增加循环数;8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度 而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些);9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚 体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100-1000倍，如果间隔较长可以稀释50-100倍;

除了楼上2位的建议，我建议可以适当增加模版浓度哈

因为引物是要和模版结合的，如果形成了二聚体就没法有效结合模板了啊没法起到引物的作用

一对引物之间,或者引物自身有连续3个以上的可以互补结合的碱基对,就容易发生聚合,形成二聚体.

是在pcr反应中,两条引物上的互补碱基相结合形成的聚合体,这种聚合体出现了,就相当于原本可以扩增的原料链减少了,即会导致扩增的效率降低,所以最好能避免这种物质的出现.

试着降低引物浓度

引物3"端末端有互补序列,这样造成引物以引物为模板进行延伸,造成引物二聚体.

首先检查模板有没问题，然后降低PCR退火温度试试，降低退火温度可增加引物的结合量，但也增加了错配可能。也可以换种PCR Mix。还不行的话换对引物二聚体少的引物。

确认是引物二聚体？请问有无做空白对照，空白对照的情况又是如何？

一般是低于100bp的~通常用DL2000的MARKER,则一般出现在最下面,100bp的条带以下~

PCR反应过程中产生引物二聚体是做PCR的各位战友经常遇到的问题，下面介绍一些减少引物二聚体的方法： 1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2. 可能模板有问题；3. 模板浓度过小，适当加大模板量；4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性； 7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体； 8. 增加循环数；9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对；11. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。

首先PCR技术扩增目的基因DNA扩增【约】为2的n此方，不是2n。这是因为目的基因的DNA受热后接旋成单链，引物再与单链件几乎不结合，并在DNA聚合酶作用下延伸，但其结合时的循环并不只有一个引物结合。

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。|||原理不同：荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光；普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量，一般是紫外光。反应要求：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小，荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析，普通pcr必须电泳。结果：荧光定量可以实现精确定量，普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率，溶解温度，直接得到的标准曲线等，这些是普通pcr无法实现的。|||这个还真不大清楚|||貌似前者是定量，后者属于半定量。|||简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。|||引物设计是sybr定量PCR法的最大难点，机会好的话，设计一对引物就能得到很好的结果，机会不好的话7、8对引物也出不来，我就遇到过这样的问题，我在prime5.0上设计了8对引物，符合实验要求的一对也没有，我把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定，后来我想通了，可能我这对引物把其它序列扩增出来了，而且扩增效率很高（我一个同学设计了十几对才找到一对好用的）。记住primer5.0设计出来的100%好的引物，到了定量PCR上不一定好使，这是我最大的经验。定量pCR的引物对匹配度要求不高，我现在使用的引物就有几个碱基不匹配，但实验结果很好。有一个办法可以帮助我们绕过引物设计这道坎，直接到罗氏网站上专区上找引物。罗氏网站在线有一个引物设计软件，你只要找好你目的基因的种属，输入你的片段序列就可以得到你要的引物。这个软件有很大的好处，他会自动地把你的种属序列背景扣除，最大限度地去除引物二聚体产生的可以。

我个人觉得你应该先从引物考虑 虽然PCR过程中受很多因素的影响但是引物和退火温度无疑是很重要的两个方面 没出现引物二聚体只能说你设计的两端的引物没有错配啊等等 你可以找有经验的师兄师姐帮你设计引物看看顺便啊学习一下引物设计的经验 引物到了之后,你可以先跑个沉降PCR看看比较适合退火温度 我也听师兄说过可以跑个TOUCHDOWN 另外你可以把Mg离子以及DNTP还有各个溶剂的量调高一些看能不能有东西用我师姐的话说如果这都跑不出那就没希望了.但是一般是可以跑出来的~

博凌科为-为你解答：PCR反应过程中产生引物二聚体是做PCR的各位战友经常遇到的问题，下面介绍一些减少引物二聚体的方法： 1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2. 可能模板有问题；3. 模板浓度过小，适当加大模板量；4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性； 7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体； 8. 增加循环数；9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一 些）；10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对；11. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果 间隔较长可以稀释50－100倍。

我个人觉得你应该先从引物考虑 虽然PCR过程中受很多因素的影响但是引物和退火温度无疑是很重要的两个方面 没出现引物二聚体只能说你设计的两端的引物没有错配啊等等 你可以找有经验的师兄师姐帮你设计引物看看顺便啊学习一下引物设计的经验 引物到了之后，你可以先跑个沉降PCR看看比较适合退火温度 我也听师兄说过可以跑个TOUCHDOWN 另外你可以把Mg离子以及DNTP还有各个溶剂的量调高一些看能不能有东西用我师姐的话说如果这都跑不出那就没希望了。。但是一般是可以跑出来的~

引物设计有 3 条基本原则：引物与模板的序列要紧密互补。引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。引物设计引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 u2206G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。设计要求做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：避免重复碱基，尤其是G。Tm=58-60度。GC=30-80%。3"端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。引物的退火温度要高，一般要在60度以上。要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的全部物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5"到 3"的下降形状也有利于引物与模板的结合；4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3"端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3"末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；8、3"端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3"端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；11、在DNA测序和PCR中最好用5"末端稳定（GC含量多），而3"端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。13、对引物的修饰一般在5"端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。

可以用于正式实验的引物必须满足以下条件：a溶解曲线单峰，窄而尖，否则可能有非特异性扩增；峰的位置横坐标一般在80度以上，这个温度为PCR产物的解链温度，如果在75度附近，可能是引物二聚体，miRNA染料法检测时，溶解曲线的峰的位置可能在75度附件b琼脂糖电泳为明亮的一条带，条带一般在100bp以上，如果设计引物时PCR产物在100bp一下，需要仔细辨认是否为引物二聚体；引物二聚体的条带一般在50bp左右，条带弥散，暗。c扩增曲线呈“S”形，一般情况下，S形越陡，扩增效率越高，S形越平，扩增效率低。有时会出现扩增曲线只有线性期，没有指数期的情况，这时一般扩增效率较低，建议检测一下扩增效率，用标准曲线法计算相对表达量。染料法的扩增曲线比探针法的扩增曲线要好看。d样品Ct值小于30，对于Ct大于30的情况，建议重新设计一对引物，重新调试。如果几对引物的Ct值都较大，可以适当放宽Ct至35。但是Ct值肯定不能大于35。

在25ul的反应体系中配置，PCR Buffer(组成：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 2.5 mMMgCl2, pH 8.3)，200μM dNTPs(200μM是指25ul体系中的dNTPs的终浓度，下面一样), 0.2 μM invA primers,-----0.2 μM终浓度的配对链引物(即上游引物)0.2μM sefA primers, -----0.2 μM终浓度的自身链引物(即下游引物)and 0.5 μM pefA primers，这个不是很清楚，估计是探针的意思2.5U of Taq DNA polymerase -------2.5U的Taq酶，一般Taq酶都是5U/ul的，所以具体加几微升就要看你买的Taq酶的浓度了，(MBI Fermentas),-----是一家公司的名字 and 0.2μl of DNA template. ------0.2ul DNA模板再加一句，剩余的体积用无菌水补足25ul

标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右.②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段.③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3"端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带.⑤引物3"端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败.⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处.⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 希望有所帮助

只要你扩增体系内添加了引物，要么会有扩增产物，要么会有二聚体，或者二者都存在，至于你说的这种情况，要么是引物降解了，要么是电泳时间长，二聚体都已经跑过了，因为引物二聚体一般分子量较小，很容易就跑出去的

不是吧，可能是非特异扩增，你提高退火温度看看。

引物二聚体一般很小，PCR产物一般较大，可以加入MARK看看大小。

引物二聚体的出现。摸索下后面的PCR条件，引物设计软件只能告诉你现在设计的引 物之间的配对，发卡结构等问题。至于后面的PCR反应时的实际情况，要试了才知 引物二聚体的形成不单单是在引物设计的时候，后面的PCR扩增条件的不适也会造成 引物二聚体的出现。摸索下后面的PCR条件，引物设计软件只能告诉你现在设计的引 物之间的配对，发卡结构等问题。至于后面的PCR ... 我设计的单链DNA不是用来做PCR的，只是为了不让他形成双链即可。 故只要在设计的时候不出现 二聚体 就好。 何不说明用途，这样才好分析，很多时候软件分析有二聚体并不影响实验 用来做蛋白质与DNA的相互作用。 二聚体，就是自己和自己配对，两条链之间间的碱基配对。caicaiyy(站内联系TA)这是不可避免的，按照概率来算，引物20bp就可有10对9对8对7对等的二聚体，每对可以配对的概率是1/4,10对就有2.5对可以配上，即使你设计他没有一对配上，但它可以移动位置配成9、8、7对等，那也可能配上。

一.引物设计和样品使用均是一样的情况，就是反应条件的问题二.反应条件就看你的实验操作和所使用的仪器，操作都一样的话，仪器设定上出问题的可能性会大一些，其中退货温度是比较关键的三.人品问题也会导致这样的情况四.一般减少引物二聚体的方法：1.从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2.可能模板有问题；3.模板浓度过小，适当加大模板量；4.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；5.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；6.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；7.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体；8.增加循环数；9.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；10.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对；11.以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。

首先在设计引物的时候,要注意避免产生引物二聚体.现在的引物设计软件都会有一个dimer的选项,可以看出你设计的引物是否会发生二聚体.如果会形成二聚体,并且序列不能有大的变动,那就注意一下在3"端别发生dimer的互补. 其次,在PCR时提高退火温度可以提高PCR的特异性,可以减少引物二聚体.

那看你是做什么实验了，基本上出现引物二聚体没什么问题的，不影响实验结果的

引物3"端末端有互补序列，这样造成引物以引物为模板进行延伸，造成引物二聚体。

引物3"端末端有互补序列，这样造成引物以引物为模板进行延伸，造成引物二聚体。

这个好专业啊，你去小木虫问问吧！

是引物的3"端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。减少PCR产物中引物二聚体的方法:1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法;2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量;3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度;4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性;6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。7.增加循环数;8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些);9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。望采纳

通过引物的参数检测引物设计参数：a引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。b引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer5，primer6，primerexpress等一般可以设置在55-58度，beacondesign可以设置在65左右。cGC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。d产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不好区分，超过200bp可能会影响PCR扩增。e软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。f引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。最好还是通过实验验证，如果是定量PCR引物a溶解曲线单峰，窄而尖，否则可能有非特异性扩增；峰的位置横坐标一般在80度以上，这个温度为PCR产物的解链温度，如果在75度附近，可能是引物二聚体，miRNA染料法检测时，溶解曲线的峰的位置可能在75度附件b琼脂糖电泳为明亮的一条带，条带一般在100bp以上，如果设计引物时PCR产物在100bp一下，需要仔细辨认是否为引物二聚体；引物二聚体的条带一般在50bp左右，条带弥散，暗。c扩增曲线呈“S”形，一般情况下，S形越陡，扩增效率越高，S形越平，扩增效率低。有时会出现扩增曲线只有线性期，没有指数期的情况，这时一般扩增效率较低，建议检测一下扩增效率，用标准曲线法计算相对表达量。染料法的扩增曲线比探针法的扩增曲线要好看。d样品Ct值小于30，对于Ct大于30的情况，建议重新设计一对引物，重新调试。如果几对引物的Ct值都较大，可以适当放宽Ct至35。但是Ct值肯定不能大于35。

你要自己先粗略看一下引物设计的是否合乎基本的一些原则，然后再用软件评价。怎么样确定上下游引物和编辑引物不用我多说吧，我就从第三个标签“analyze"说起吧。1、duplex formation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，主要是看引物3‘端有无配对碱基(最好没有)。其中的current oligo是当你对引物进行了编辑（如加入酶切位点）时，对原始引物进行的分析。（下同）形成的二聚体要看能值G(得它不会输入啊！)，能值越低越好，最好不要超过4.5（下同）2、hairpin formation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3"端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。如果引物中加入酶切位点，可能会有发夹结构且能值不会太低，这就需要灵活控制退火温度了。3、composition and Tm:分析上下游引物的碱基组成，GC比和Tm值，原则我就不多说了。4、false priming site: 如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3‘端）是否与特定模板的其他位点结合。一般错配的引发效率以不超过100为好，但并不绝对，如果正确结合位点的引发效率为450以上，而有一个错配的引发效率是120左右的，这个引物也是可以接受地！！5、PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，尤其是给了一个optimal annealing tem还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。引物主要的评价功能也就这些了，应付一些基本的引物分析足够了。这是我个人参阅具体文献及实践所得

首先有一段双链模板DNA，根据模板DNA两端的序列设计两条引物，每条引物与其中一条链互补。如下图所示。引物1-->5‘ XXXXXXXXXX 3"3‘ XXXXXXXXXX 5" <--- 引物2在PCR反应过程中，每条引物结合一条模板DNA链，从5‘-3"方向开始扩增，所以最后扩增得到的序列就只能是在两条引物之间的序列。可以找一些原理图看一下，就比较容易理解了。

1、扩增曲线（如果做双ΔCT法）：（1）扩增曲线必须是S型，有明显的四个时期，且复孔的CT值尽量一致，相差不要超过0.5个CT值（上限是1个CT值）；（2）同一个基因在不同浓度的相同模板下扩增，其相差的CT值为相差浓度倍数的2次开方。当然这是理论值；另外阴性对照不能有扩增（40个循环以后出CT值属正常现象，也可算作没有扩增）。2、溶解曲线：（1）溶解曲线是判断扩增产物是否单一的曲线，顾名思义，其跟模板（或其浓度）没有关系，扩增什么基因就应该有其相对应的溶解曲线；（2）一般SYBR法的目的基因在80~90℃之间；（3）出现其他峰就该考虑是否为引物二聚体（一般为60~75℃之间）视引物长度而定，而基因组DNA污染的峰会在90℃以后。出现引物二聚体可能是引物设计、引物加量等原因所致；（4）基因组DNA那么考虑设计跨内含子引物或者实验之前做gDNA的消除工作。而阴性对照有目的峰那可能就是模板污染，注意实验操作等避免模板污染。3、溶解曲线是为了验证扩增产物特异性的，要是溶解曲线是单峰说明产物只有一条，结果较好；要是双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，有可能引物设计有问题。扩展资料：溶解曲线分析：1、可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。2、扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低。3、用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，4、溶解曲线是为了观察扩增发出荧光的片段是不是需要的产物。如果溶解曲线做出来只有单峰，且出锋位置是退火温度，那么这个是产物发出的荧光，实验结果有效。参考资料：百度百科——Realtime PCR溶解曲线

引物二聚体是PCR扩增时，正反向引物结合。非特异性扩增是引物和模板有结合位点，因为即使引物和模板有3个碱基的差异（5`端），扩增的可能性还是很大的

恩 对酶切影响不大 但会影响后面的连接 每一步做完最好都跑胶回收 不能偷懒~

首先检查模板有没问题,然后降低PCR退火温度试试,降低退火温度可增加引物的结合量,但也增加了错配可能.也可以换种PCR Mix.还不行的话换对引物二聚体少的引物.