色谱法 有什么意义？

由于现代色谱分析技术具有分离和分析两种功能，即能排除复杂组分间的相互干扰，逐个将组分进行定性和定量分析，因此，现代色谱分析技术非常适合成分复杂的生药的有效性评价。

色谱法根据其分离原理可分为：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法与排阻色谱法等。吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱使组分分离；常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分离；其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相，另一相为液体或气体，称为流动相；常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分离；常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，是利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离；常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作为流动相。

常用色谱法又可根据分离方法分为：薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等。采用薄层色谱法分离有色物质时，可根据其色带进行区分；分离无色物质时，可在短波 (254nm) 或长波 (365nm) 紫外光灯下检视，也可喷以显色剂使之显色，或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光猝灭法检视。气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。

近年来随着各种色谱仪器自动化程度的提高，特别是各种联用技术的发展，使得用现代色谱分析技术进行生药有效性评价和质量控制变得越来越快速、简便和灵敏。

（一）薄层色谱法 (thin layer chromatography, TLC)

薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。《中国药典》 (2005 年版 ) 一部薄层色谱法用于定性鉴别的达 1 523 项，用于含量测定的为 45 项，其中有 4 种药材采用薄层扫描法定量。

1. 操作方法

(1) 薄层板 有市售薄层板（普通或高效板）和自制薄层板，可根据需要选用。

(2) 点样 通常在洁净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动或自动点样器械将样品点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边 10 ～ 15mm ，高效板一般基线距底边 8 ～ 10mm 。圆点状直径一般不大于 3mm ，高效板一般不大于 2mm ；接触点样时注意勿损伤薄层板表面。条带状宽度一般为 5 ～ l0mm 。高效板条带宽度一般为 4 ～ 8mm ，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于 8mm ，高效板供试品间隔不少于 5mm 。

(3) 展开 将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点 5mm 为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开 8 ～ 15cm ，高效薄层板上行展开 5 ～ 8cm 。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。

展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持 15 ～ 30 分钟。溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。必要时，可进行二次展开或双向展开。

(4) 显色与检视 供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色或加热显色，在日光下检视。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在 365nm 紫外光灯下观察荧光色谱。对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板 ( 如硅胶 GF 254 板 ) ，在 254nm 紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。

(5) 记录 薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层扫描仪扫描记录相应的色谱图。

2. 系统适用性试验

用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整，使检测灵敏度、分离度和重复性符合要求。

(1) 检测灵敏度 用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。

(2) 分离度 用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度 (R) 的计算公式为：

R ＝ 2(d 2 -d 1 ) ／ (W 1 +W 2 ) 式 (3-5)

式中， d 2 为相邻两峰中后一峰与原点的距离； d 1 为相邻两峰中前一峰与原点的距离； W 1 及 W 2 为相邻两峰各自的峰宽。通常分离度应大于 1.0 。

(3) 重复性 同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 3.0 ％；需显色后测定的相对标准偏差应不大于 5.0 ％。

3. 测定法

(1) 鉴别 取适宜浓度的对照品溶液与供试品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色 ( 或荧光 ) 和位置应与对照溶液的斑点一致。

(2) 限度检查 采用与定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色 ( 或荧光 ) 不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，峰面积值不得大于对照品的峰面积值。

(3) 含量测定 照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。

4. 薄层色谱扫描法

系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。通常含量测定应使用市售薄层板。

扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的比移值 (R f 值 ) 和光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与对照品同板点样、展开、测定和计算。

（二）高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography, HPLC)

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、重现性好、准确度和灵敏度高等优点，其应用范围之广，是其它分析仪器所不能比拟的。随着仪器的普及和蒸发光散射检测器、质谱检测器的商品化，本法已成为生药含量测定的首选和主流方法。《中国药典》 (2005 年版）一部应用高效液相色谱法测定含量的中药品种达 479 种，涉及 518 项，其中药材就有 98 种 。

1. 对仪器的一般要求

(1) 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶 ( 如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等 ) 也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。

填充剂的性能 ( 如载体的形状、粒径、孔径、比表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等 ) 以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在 15nm(1nm=l0?) 以下的填充剂适合于分析分子量小于 2000 的化合物，分子量大于 2 000 的化合物则应选择孔径在 30nm 以上的填充剂。

以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用 pH2 ～ 8 的流动相。当 pH 大于 8 时，载体硅胶会被溶解；当 pH 小于 2 时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用 pH 大于 8 的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机 - 无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用 pH 小于 2 的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机 - 无机杂化填充剂等。这些特殊的色谱柱已有商品供应。

(2) 检测器 最常用的检测器为紫外检测器 ( ultraviolet detector, UVD) ，其他常见的检测器有二极管阵列检测器 ( diode array detector, DAD) 、荧光检测器 ( fluorescence detector, FLD) 、示差折光检测器 ( refractive index detector, RID) 、蒸发光散射检测器 (evaporative light-scattering detector, ELSD) 、电化学检测器 (electrochemical detector, ECD) 和质谱检测器 (mass spectrometrical detector, MSD) 等。

紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关。二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测定和色谱峰的纯度检查。

紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。

不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外 - 可见分光光度法对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。

(3) 流动相 可采用固定比例 ( 等度洗脱 ) 或按规定程序改变比例 ( 梯度洗脱 ) 的溶剂组成作为流动相系统。由于 C- 18 链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于 5 ％，否则 C 18 链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

2. 系统适用性试验

色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。

通常用规定的对照品对色谱系统进行系统适用性试验。

(1) 色谱柱的理论板数 (n) 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间 t R ( 以分钟或长度计，下同，但应取相同单位 ) 和半高峰宽 (W h/2 ) ，按 n=5.54(t R ／ W h/2 ) 2 计算色谱柱的理论板数。

(2) 分离度 (R) 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为：

3) 重复性 取对照品溶液，连续进样 5 次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0 ％。也可配制相当于 80 ％、 100 ％和 120 ％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成 3 种不同浓度的溶液，分别至少进样 2 次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于 2.0 ％。

(4) 拖尾因子 (T) 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合相关规定。

3. 测定法

(1) 内标法加校正因子测定供试品中某个成分含量 精密称 ( 量 ) 取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照品溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：

校正因子 (f)= 式 (3-8)

式中 As 为内标物质的峰面积或峰高； A R 为对照品的峰面积或峰高； C S 为内标物质溶液的浓度； C R 为对照品溶液的浓度。

再取含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

含量 (C x ) =f × 式 (3-9)

式中 A x 为供试品峰面积或峰高； C x 为供试品溶液的的浓度； A′ s 为内标物质的峰面积或峰高； C′ s 为内标物质的浓度。 f 为校正因子。

当配制校正因子测定用的对照品溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时， C s =C′ s ，则配制内标物质溶液不必精密称 ( 量 ) 取。

(2) 外标法测定供试品中某个成分含量 精密称 ( 量 ) 取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图。

由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。

(3) 面积归一化法 是测量色谱图上某色谱峰和除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算某色谱峰占总面积的百分率。该法通常用于对照品纯度的检查。

高效液相色谱法样品进样前的溶液应澄清，通常需经微孔滤膜 (0.45μm) 滤过。

（三）气相色谱法 (gas chromatography, GC)

气相色谱法系采用气体为流动相 ( 载气 ) 流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

气相色谱法对含挥发性成分的生药应用较广，精密度高，分离效果比薄层色谱好，但所得数据只有保留时间，多数情况下是在高温下进行，若成分不气化，就不能进行分析，故应用范围受到限制。虽可通过衍生化法或应用特殊色谱柱分析不易挥发的成分，但远不如高效液相色谱方便、准确。《中国药典》 (2005 年版 ) 气相色谱法用于中药分析的品种有 47 种，其中有 4 种药材用此法定量。另外还有两种药材的农药残留也是用 GC 法分析。

1. 对仪器的一般要求

气相色谱仪由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。

(1) 载气源 气相色谱法的流动相为气体，称为载气，氦、氮和氢可用作载气，可由高压钢瓶或高纯度气体发生器提供，经过适当的减压装置，以一定的流速经过进样器和色谱柱；根据供试品的性质和检测器种类选择载气，常用载气为氮气。

(2) 进样部分 进样方式一般可采用溶液直接进样或顶空进样。

溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样；采用溶液直接进样时，进样口温度应高于柱温 30 ～ 50℃ ；进样量一般不超过数微升；柱径越细，进样量应越少，采用毛细管柱时，一般应分流以免过载。

顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。将固态或液态的供试品制成供试液后置于密闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性组分在非气态和气态达至平衡后，由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱中。

(3) 色谱柱 色谱柱为填充柱或毛细管柱。填充柱的材质为不锈钢或玻璃，内径为 2~4mm ，柱长为 2~4m ，内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体，粒径为 0.25~0.18mm 、 0.18~0.15mm 或 0.15~0.125mm 。常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛细管柱的材质为玻璃或石英，内壁或载体经涂渍或交联固定液，内径一般为 0.25mm 、 0.32mm 或 0.53mm ，柱长 5~60m ，固定液膜厚 0.1~5.0μm ，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛细管柱在使用前需老化以除去残留溶剂及低分子量的聚合物，色谱柱如长期未用，使用前应老化处理，使基线稳定。

(4) 柱温箱 由于柱温箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性，因此柱温箱控温精度应在 ±l℃ ，且温度波动小于每小时 0.1℃ 。温度控制系统分为恒温和程序升温两种。

(5) 检测器 适合气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器 ( flame ionization detector , FID) 、热导检测器 ( thermal conductivity detector, TCD ) 、氮磷检测器 (nitrogen-phosphorus detector, NPD) 、火焰光度检测器 ( flame photometric detector , FPD) 、电子捕获检测器 ( electron capture detector , ECD) 、质谱检测器 (mass spectrometric detector, MSD) 等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的化合物；氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高；火焰光度检测器对含磷、硫元素的化合物灵敏度高；电子捕获检测器适于含卤素的化合物；质谱检测器能给出供试品某个成分相应的结构信息，可用于结构确证。常用检测器为火焰离子化检测器，用氢气作为燃气，空气作为助燃气，在使用火焰离子化检测器时，检测器温度一般应高于柱温，并不得低于 150℃ ，以免水汽凝结，通常为 250 ～ 350℃ 。

(6) 数据处理系统 可分为记录仪、积分仪以及色谱工作站等。

2. 系统适用性试验

同高效液相色谱法。

3. 测定法

(1) 内标法加校正因子测定供试品中某成分含量。

(2) 外标法测定供试品中某成分含量。

(3) 面积归一化法。

上述 (1)~(3) 法的具体内容均同于高效液相色谱的相应方法。

(4) 标准溶液加入法测定供试品中某成分含量 精密称 ( 量 ) 取某待测成分对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定待测成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试液溶液中某待测成分含量。

气相色谱法定量分析，当采用手工进样时，由于留针时间和室温等对进样量的影响，使进样量不易精确控制，故最好采用内标法定量；而采用自动进样器时，由于进样重复性的提高，在保证进样误差的前提下，也可采用外标法定量。当采用顶空进样技术时，由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中，故可采用标准溶液加入法以消除基质效应的影响；当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。

（四）其它色谱分析方法

1. 高效毛细管电泳 (high performance capillary electrophoresis, HPCE)

高效毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或分配系数的不同进行高效、快速分离的新型 “ 液相色谱 ” 技术，它是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为了可能，成为生物化学和分析化学中最受瞩目的、发展最快的一种分离分析技术，它在复杂样品的分离分析中将扮演越来越重要的角色。

2. 毛细管电色谱 (capillary electrochromatography ， CEC ）

毛细管电色谱是综合了毛细管电泳 (capillary electrophoresis ， CE) 和高效液相色谱 (HPLC) 的优势而发展起来的新型高效电分离微柱液相色谱技术。 CEC 一般采用熔融的石英毛细管柱，在柱内填充或管壁键合固定相，用高压直流电源 ( 或外加一定的压力）代替高压泵，产生电渗流 (electroosmotic flow ， EOF) 代替压力驱动流动相，溶质依据它们在流动相与固定相中的分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得到分离，因而既能分离中性物质又能分离带电组分。

近年来高效毛细管电泳和毛细管电色谱在生药化学成分的分析中有许多尝试，取得显著进展。

只要意义??

色谱法又称色谱分析、色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。

说白了主要意义是鉴别物质,提纯分离物质,以及确定物质的分子结构等.

色谱是个很广泛的概念，现在常用的手段包括：紫外可见黄光谱（UV），X光谱 （X－ray diffraction)，核磁共振（NMR)等。

色谱一般来说是用来鉴定分子结构的，每个分子都有它特定的色谱图谱，依靠色谱就能鉴定未知物为何物。此外有坚定样品纯度等功能。

具体问题欢迎来信探讨

由于现代色谱分析技术具有分离和分析两种功能，即能排除复杂组分间的相互干扰，逐个将组分进行定性和定量分析，因此，现代色谱分析技术非常适合成分复杂的生药的有效性评价。